1 目的
1.1 了解牛乳自然發酵過程中微生物菌相的變化過程。
1.2 了解酸牛乳的製作原理。
2 原理
剛采集的生牛乳含有細菌數量並不多。但是，由於牛乳的成份適合多種細菌生長，因此在溫度適宜的條件下，細菌繁殖很快，而且菌相出現交替演變的現象。一般剛采集的生牛乳的pH是中性，含有豐富的乳糖，有利於生牛乳中自然存在的乳酸細菌，例如乳鏈球菌(Streptococcus lactis)很快地繁殖。它們發酵乳糖產生乳酸，使牛乳的pH降低，並引起蛋白質凝結成乳酪狀。低pH最終也抑製了乳鏈球菌的繁殖，被能耐受更低pH的的菌種乳杆菌（Lactobacillus）所代替，它們完成乳糖發酵，並使pH更加降低。在這種低pH條件下酵母菌利用乳酸而生長。隨著乳糖和乳酸的減少，pH再度上升，大部分假單孢菌（Pseudomonas）和芽孢杆菌（Bacillus）生長繁殖它們產生的蛋白酶，開始分解凝結了的牛乳蛋白質，當蛋白質被利用，牛奶的分解基本完成。
生牛乳的這種生態學演變的自然過程中。原始細菌的活動為以後的細菌創造了有利的生化條件，因而能觀察到一個微生物群體接替另一微生物群體的一係列菌相演變。自然界其它微生物也會發生菌相的演變過程。
巴斯德消毒法可以殺滅牛乳中的病原菌，但不能殺滅芽孢杆菌，此法消毒過的牛乳，破壞了其中的正常菌群（除芽孢杆菌以外），因而不能產生帶酸味的酸牛乳，而能越過演變的早期而趨向於更不適用的最後時期。故牛乳酸敗的自然過程與乳品工業有密切的關係。現代工業生產的酸牛乳是先將牛乳進行消毒，而後接種乳鏈球菌與乳杆菌的純種。
本實驗將生牛乳原始樣品和培養在30℃下的樣品，定時取樣分別測其pH並塗片，進行革蘭氏染色，油鏡下觀察主要細胞的形態、排列、革蘭氏陽性或陰性以及單個視野中的平均細菌數。每次塗片均取一接種環，塗抹載玻片約2.5cm2麵積。
3 材料
3.1 樣品
生牛乳樣品裝入三角燒瓶內，
3.2 試劑
革蘭氏染色液 二甲苯等
3.3儀器和器具
pH試紙，載玻片，蓋玻片，顯微鏡等。
4 流程
勻樣→測pH→塗片→存片→培養→循環→塗片處理→染色→觀察計數
5 方法
5.1 混勻樣品
旋轉裝牛乳的三角燒瓶，使樣品充分混勻。
5.2 測pH值
用滅菌滴管或吸管以無菌操作取一滴牛乳或牛乳發酵液，放在pH試紙上，比色，記錄。
5.3 製作塗片
用無菌操作取滿一接種環牛乳，在玻片上均勻塗抹2.5cm2麵積（可先在紙上畫2.5cm2的方格，然後將玻片放在紙上），玻片標明日期。
5.4 貯存塗片
玻片放空氣中幹燥。貯存在一有蓋盒內，待整個實驗的所有塗片製成後一起進行第7以後的步驟或每片先進行第7步驟，再貯存，待所有玻片製成後再進行第8以後的步驟。
5.5 保溫培養
牛乳樣品放30℃溫箱內培養。整個實驗（約需10天）均需在此溫度下培養。
5.6 循環實驗（測pH與塗片）
每兩天重複取樣測pH和製作塗片。每次製作塗片用同一接種環，取同樣的量。直至牛乳完成變酸過程和開始腐敗為止。
5.7 處理塗片
所有塗片都用二甲苯處理約1分鍾，以除去牛乳的脂肪，幹燥後，火焰固定。
5.8 革蘭氏染色。
5.9 觀察計數
油鏡下觀察，數幾個視野的主要類型的細菌數，計算每一視野的平均數，描寫細菌類型，注明形態、大小以及排列等性狀。
6 結果
6.1 記錄每次測得的pH和描寫塗片中所觀察到的細菌，並根據描寫的細菌情況對照所介紹的各個時期的細菌特點，鑒別細菌類型。最後計算每一類型細菌在油鏡下平均每視野的近似數。
6.2 用上表數據畫曲線
6.2.1 pH曲線
以取樣日期的垂直線與右麵縱軸pH的水平線的交叉處畫點，然後用連續線（ ）連接各點。
6.2.2 各細菌的曲線
以取樣日期與左麵各類型細菌的每視野平均數畫交叉點，然後按各菌的曲線標記連接各點畫曲線。
7 思考
1 用自己的實驗結果說明細菌在牛乳的自然生態演變中是如何改變其環境的，又如何依次影響有關細菌的？
2 經巴氏法消毒過的牛乳通過自然發酵，能否得到與生牛乳自然演變過程的同樣結果？為什麽？
3 如果你利用生牛乳通過細菌自然發酵製造能飲用的酸牛乳，應控製在哪一時期
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