一 醬油種曲孢子數
1 目的
掌握應用血球計數板測定孢子數方法。
2 原理
種曲是成曲的曲種，是保證成曲的關鍵，是釀製優質醬油的基礎。種曲質量要求之一是含有足夠的孢子數量，必須達到6×109個/g（幹基計）以上，孢子旺盛、活力強、發芽率達85%以上，所以孢子數及其發芽率的測定是種曲質量控製的重要手段。測定孢子數方法有多種，本實驗采用血球計數板在顯微鏡下直接計數，這是一種常用的細胞計數方法。此法是將孢子懸浮液放在血球計數板與蓋片之間的計數室中，在顯微鏡下進行計數。由於計數室中的容積是一定的，所以可以根據在顯微鏡下觀察到的孢子數目來計算單位體積的孢子總數。
實驗中，稱樣時要盡量防止孢子的飛揚。測定時，如果發現有許多孢子集結成團或成堆，說明樣品稀釋未能符合操作要求，因此必須重新稱重、振搖、稀釋。生產實踐中應用時，種曲通常以幹物質計算。
3 材料
3.1 樣品
醬油種曲
3.2儀器和器具
蓋玻片，旋渦均勻器，血球計數板，電子天平，顯微鏡。
3.3 試劑
95%酒精，稀硫酸（1∶10）。
4 流程
曲種→稱量→稀釋→過濾→定容----製記數板----計算？
5 方法
5.1樣品稀釋
精確稱取種曲1g（稱準至0.002g），倒入盛有玻璃珠的250ml三角瓶內，加入95%酒精5ml、無菌水20ml、稀硫酸（1:10）10ml，在旋渦均勻器上充分振搖，使種曲孢子分散，然後用三層紗布過濾，用無菌水反複衝洗，務使濾渣不含孢子，最後稀釋至500ml。
5.2製計數板
取潔淨幹燥的血球計數板蓋上蓋玻片，用無菌滴管取孢子稀釋液1小滴滴於蓋玻片的邊緣處（不宜過多），讓滴液自行滲入計數室中，注意不可有氣泡產生。若有多餘液滴，可用吸水紙吸幹，靜止5min，待孢子沉降。
5.3觀察計數
5.3.1 觀察
用低倍鏡頭和高倍鏡頭觀察，由於稀釋液中的孢子在血球計數板上處於不同的空間位置，要在不同的焦距下才能看到，因而計數時必須逐格調動微調螺旋，才能不使之遺漏，如孢子位於格的線上，數上線不數下線，數左線不數右線。
5.3.2 計數
使用16×25規格的計數板時，隻計板上四個角上的4個中格（即100個小格），如果使用25×16規格的計數板時，除計四個角上的4個中格外，還需要計中央一個中格的數目（即80個小格）。每個樣品重複觀察計數不少於2次，然後取其平均值。
5.4計算
（1）16×25的計數板
孢子數（個/g）=(N/100) ×400×10000×(V/G)=4×104×(NV/G)…………（1）
式中 N——100小格內孢子總數 （個）
V——孢子稀釋液體積 （ml）
G——樣品重量 （g）
（2） 25×16的計數板
孢子數（個/g）=(N/80) ×400×10000×(V/G)=5×104×(NV/G) …………………………（2）
式中 N——80小格內孢子總數 （個）
V——孢子稀釋液體積 （ml）
G——樣品重量 （g）
5 流程
曲種→稱量→稀釋→過濾→定容→製計數板→觀察計數→計算
6 結果
樣品稀釋至每個小格所含孢子數在10個以內較適宜，過多不易計數，應進行稀釋調整。結果記入下表。
計算次數 各中格孢子數 小格平均孢子數 稀釋倍數 孢子數
（個/g） 平均值
第一次
第二次
7 思考
用血球計數板孢子計數有什麽優缺點？
二 孢子發芽率測定法
1 目的
學習孢子發芽率的測定方法
2 原理
測定孢子發芽率的方法常有液體培養法和玻片培養法，部頒標準采用玻片培養法。本實驗應用液體培養法製片在顯微鏡下直接觀察測定孢子發芽率。孢子發芽率除受孢子本身活力影響外，培養基種類、培養溫度、通氣狀況等因素也會直接影響到測定的結果。所以測定孢子發芽率時，要求選用固定的培養基和培養條件，才能準確反映其真實活力。
3 材料
3.1 樣品
種曲孢子粉
3.2 培養基
察氏液體培養基
3.3 儀器和器具
載玻片、蓋玻片、顯微鏡，接種環，酒精燈，恒溫搖床
4 流程
種曲孢子粉→接種→恒溫培養→製標本片→鏡檢→計數
5 方法
5.1 接種
用接種環挑取種曲少許接入含察氏液體培養基的三角瓶中，置於30℃下搖床振蕩恒溫培養3—5 h。
5.2 製片
用無菌滴管取上述培養液於載玻片上滴一滴，蓋上蓋玻片，注意不可產生氣泡。
5.3 鏡檢
將標本片直接放在高倍鏡下觀察發芽情況，標本片至少同時做二個，連續觀察兩次以上，取平均值，每次觀察不少於100個孢子發芽情況。
54 計算
發芽率（%）=A/（A+B）×100
式中 A——發芽孢子數 （個）
B——未發芽孢子數 （個）
6 結果
6.1正確區分孢子的發芽和不發芽狀態。
6.2培養前要檢查調整孢子接入量，以每個視野含孢子數10—20個為宜。
6.3 實驗結果記入下表
孢子發芽數（A） 發芽和未發芽孢子數（A+B） 發芽率（%） 平均值
7 思考
影響孢子發芽率的因素有哪些？哪些實驗步驟容易造成結果誤差？
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