厭氧菌的分離與鑒定

 

表5．22．4厭氧菌直接鏡檢初步鑒別

 

 

 

 

　　根據形態和染色性，結合標本性狀與氣味，初步對標本中可能有的細菌作出估計。

 

 

　　主要分初代培養和次代培養兩個階段，其中初代培養相對比較困難，關鍵的問題就是厭氧環境和培養基的選擇。初代培養的一般原則是：

 

　　a．先將標本塗片染色直接鏡檢，指導培養基的選擇。

 

　　b．盡量選用在厭氧菌中覆蓋麵寬的非選擇性培養基。

 

　　c．最好多選1~2種覆蓋麵不同的選擇性培養基。

 

　　d．盡量保證培養基新鮮。

 

　　e．要考慮到微需氧菌存在的可能。

 

　　1．選用適當的培養基接種，應接種固體和液體兩種培養基。

 

　　(1)培養基的使用：應注意下列各點：

 

　　1)盡量使用新鮮培養基，2～4h內用完；

 

　　2)應使用預還原培養基，預還原24～48h更好；

 

　　3)可采用預還原滅菌法製作的培養基(用前於培養基中加入還原劑，如L-半胱氨酸、硫乙醇酸鈉、維生素C及葡萄糖等，盡可能使預還原劑處於還原狀態)；

 

　　4)液體培養基應煮沸l0min，以驅除溶解氧，並迅速冷卻，立即接種；

 

　　5)培養厭氧菌的培養基均應營養豐富，並加有還原劑與生長刺激因子(血清、維生素K、氯化血紅素、聚山梨酯-80等)。

 

　　(2)培養基的選擇：初次培養一般都使用選擇培養基和非選擇培養基。

 

　　1)非選擇培養基：本培養基使分離的厭氧菌不被抑製，幾乎能培養出所有的厭氧菌。常使用心腦浸液瓊脂(BHI)、布氏瓊脂(BR)、胰豆腖肝粉瓊脂(GAM)、胰腖酵母瓊脂(EG)、CDC厭氧血瓊脂等。

 

　　2)選擇培養基：為有目的的選擇常見厭氧菌株，以便盡快確定厭氧的種類。常用的有KVLB血平板(上述非選擇培養基中加卡那黴素和萬古黴素)、KVLB凍溶血平板(置～20℃，5～10min，以利產黑素類杆菌早期產生黑色素)、七葉苷膽汁平板(BBE，用於脆弱類杆菌)、FS培養基(梭杆菌選擇培養基)、ES培養基(優杆菌選擇培養基)、BS培養基(雙歧杆菌選擇培養基)、卵黃(EYA)及兔血平板(RBA)(用於產氣莢膜梭菌)、VS培養基(用於韋榮球菌)、CCFA培養基(艱難梭菌選擇培養基)等。

 

　　2．每份標本至少接種3個血平板，分別置於有氧，無氧及5％～l0％C0₂環境中培養，以便正確地培養出病原菌，從而判斷其為需氧菌、兼性厭氧菌、微需氧菌或厭氧菌中的哪一類。

 

　　3．厭氧培養法

 

　　(1)厭氧罐培養法：在嚴密封閉的罐子內，應用物理或化學的方法造成無氧環境進行厭氧培養。常用冷觸媒法、抽氣換氣法，鋼末法和黃磷燃燒法。

 

　　(2)氣袋法：利用氣體發生器產生二氧化碳和氫氣，後者在觸媒的作用下與罐內的氧氣結合成水，從而造成無氧環境。

 

　　(3)氣體噴射法：又稱轉管法。本法係從培養基的製備到標本的接種直至進行培養的全過程，均在二氧化碳的不斷噴射下進行。本法的關鍵是有無氧和C02。

 

　　(4)厭氧手套箱培養法：是迄今厭氧菌培養的最佳儀器之一，該箱由手套操作箱與傳遞箱兩部分組成，前者還附有恒溫培養箱，通過厭氧手套箱可進行標本接種、培養和鑒定等全過程。

 

　　(5)其他培養法：平板焦性沒食子酸法；生物耗氧法；高層瓊脂培養法。

 

　　4．厭氧狀態的指示美藍和刃天青。無氧時均呈白色，有氧時美藍呈藍色，刃天青呈粉紅色。

 

　　5．分離培養厭氧菌失敗的原因 培養前未直接塗片和染色鏡檢；標本在空氣中放置太久或接種的操作時間過長；未用新鮮配製的培養基；未用選擇培養基；培養基未加必要的補充物質；初代培養應用了硫乙醇酸鈉；無合適的厭氧罐或厭氧裝置漏氣；催化劑失活；培養時間不足；厭氧菌的鑒定材料有問題。

 

　　6．鑒定試驗可根據厭氧菌的菌體形態、染色反應、菌落性狀以及對某些抗生素的敏感性作出初步鑒定。最終鑒定則要進行生化反應及終末代謝產物等項檢查。

 

　　(1)形態與染色：可為厭氧菌的鑒定提供參考依據。

 

　　(2)菌落性狀：不同的厭氧菌其菌落形態和性質不同。梭菌的菌落特點是形狀不規則的，而無芽胞厭氧菌多呈單個的圓形小菌落。色素、溶血特點以及在紫外線下產生熒光的情況也可以作為厭氧菌鑒定的參考依據。

 

　　(3)抗生素敏感性鑒定試驗：常用的抗生素有卡那黴素及甲硝唑。卡那黴素可用於梭杆菌屬與類杆菌屬的區分，甲硝唑用於厭氧菌與非厭氧菌的區分。

 

　　(4)生化特性：主要包括多種糖發酵試驗、吲哚試驗、硝酸鹽還原試驗、觸酶試驗、卵磷脂酶試驗、脂肪酸酶試驗、蛋白溶解試驗、明膠液化試驗、膽汁肉湯生長試驗以及硫化氫試驗等。目前有多種商品化的鑒定係統可以使用。

 

　　(5)氣液相色譜：可以利用該技術來分析厭氧菌的終末代謝產物，已成為鑒定厭氧菌及其分類的比較可靠的方法。