【摘要】 目的 研究鮑曼不動杆菌耐藥性與耐藥基因之間的關係
【關鍵詞】 鮑曼不動杆菌; 多重耐藥基因; 耐藥基因檢測
Study on antibiotics resistance and resistant genes of Acinetobacter baumannii
XU Jing-feng，XU-Lin ,FAN Wei-hong.General Hospital of Beijing Military Command, Beijing 100700，China
【Abstract】 Objective Objective To study the relationship between antibiotic resistance and resistant gene of Acinetobacter baumannii.Methods The antibiotic resistance and resistant gene was determined by polymerase chain reaction（PCR）and with WHONET
【Key words】 Acinetobacter baumannii;drug multiresistant;drug resistant gene detection
鮑曼不動杆菌已成為醫院獲得性肺炎的重要致病菌,且很容易在監護病房流行。由於鮑曼不動杆菌在自然界的廣泛存在及其複雜的耐藥機製,對β內酰胺類、氨基糖苷類以及喹諾酮類抗生素已呈現多重耐藥，給臨床治療其所致感染帶來很
1 材料與方法
1.1 菌株來源 331株鮑曼不動杆菌均為我院臨床標本中分離並按全國統
1.2 儀器試劑 VITEK-2型全自動微生物分析儀、ID-GN 鑒定卡、AST-GN09藥敏卡由法國Bio-Merieux公司生產; VITEK 比濁計（V 1210） 由日本生產；PCR擴增儀為美國PERKIN ELMER公司9600型基因擴增儀；日本三洋MDF型超低溫冰箱;德國Hettich公司22R型低溫超速離心機;美國水套式恒溫培養箱。
1.3 菌種鑒定、藥敏 所有實驗菌株分離純化後按VITEK-2的使用要求配製成菌懸液和稀釋液, 分別填充到ID-GN和AST-GN09卡中, 用VITEK-2儀器自動完成細菌的鑒定和藥敏實驗。
1.4 質控菌株 由衛生部臨床檢驗中心提供的標準菌株大腸埃希菌（ATCC 25922）、銅綠假單胞菌（ATCC 27853）, 藥敏質控結果符合NCCLS 藥敏質控要求。
1.5 統計學處理［2］ 細菌耐藥性分析用 WHONET5軟件進行分析，耐藥率顯著性差異用SPSS10.0統計軟件分析,兩組耐藥率比較應用χ2檢驗。
1.6 耐藥基因的檢測 采用堿裂解法和蛋白酶K法提取被測細菌的質粒和染色體基因,提取方法根據不同引物設立不同PCR條件；以ATCC700603肺炎克雷伯菌和TEM-26型大腸埃希菌分別作SHV型和TEM型陽性對照；其餘 ampC、PER-1、OXA-23基因陽性對照均為北京華明公司基因檢測室經基因測序後比對的陽性菌株。
1.7 PCR耐藥菌基因［3］ 根據GenBank提供的耐藥基因，采用Primer軟件設計引物（見表1）。反應體係均為25μl,其中緩衝液2.5μl,10mmol/L 4×dNTP 0.5μl,50μmol/上下遊引物各1μl,DNA多聚酶0.25μl,DNA模板1μl,超純水18.75μl 。根據不同引物設立不同PCR反應條件。以ATCC700603肺炎克雷伯菌作SHV型陽性對照，以TEM-26型大腸埃希菌作TEM型陽性對照,產物經電泳,在紫外線下觀察結果,並在凝膠上成像。表1 用於檢測各種耐藥基因的引物（略）
2 結果與分析
2.1 鮑曼不動杆菌的臨床分布 本文鮑曼不動杆菌均來源於本院的住院病人，其中2006年160株,按標本分為血（6株）、痰（136株）、尿（6株）和其他分泌物12株；2005年171株, 按標本分為尿（5株）、痰（82株）和其他分泌物（89株）。
2.2 鮑曼不動杆菌對常用5大類21種抗生素的藥敏結果 見表2。2006年和2005年鮑曼不動杆菌對21種抗生素的平均耐藥率分別為62.8%和59.8%，經χ2檢驗，差異無顯著性（P>0.05）。2006年鮑曼不動杆菌對頭孢曲鬆、頭孢唑啉和頭孢替坦的耐藥率均為100%；對頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢呋辛鈉和頭孢呋辛酯的耐藥率分別為57.7%、44.6%、98.0%和98.0%；對β內酰胺和碳青黴烯類如氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、呱拉西林、呱拉西林/他唑巴坦、氨曲南的耐藥率分別為100%、48.3%、54.4%、17.7%和75.8%，對亞胺培南和美洛培南的耐藥率分別為23.5%和38.3%。2005年鮑曼不動杆菌對頭孢曲鬆和頭孢替坦的耐藥率均為100%；對頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢呋辛鈉、頭孢呋辛酯和頭孢唑啉的耐藥率分別為43.9%、37.2%、92.1%、92.1%和96.5%；對β內酰胺和碳青黴烯類如氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、呱拉西林、呱拉西林/他唑巴坦、氨曲南的耐藥率分別為100%、49.5%、55.2%、15.2%和86.9%，對亞胺培南和美洛培南的耐藥率分別為28.9%和34.9%。2006和2005年鮑曼不動杆菌對呋喃妥因的耐藥率均為100%，對左旋氧氟沙星和環丙沙星的耐藥率分別為8.4%、21.5%和75.4%、54.4%。表2 鮑曼不動杆菌對抗生素的耐藥率 （略）注：2006與2005年的耐藥率比較，※P<0.05
2．3 多重耐藥菌的藥敏結果 從2006年分離的42株多重耐藥鮑曼不動杆菌對18種抗生素的藥敏結果見表3。42株（100%）菌株對頭孢曲鬆、頭孢呋辛鈉、頭孢呋辛酯、頭孢唑啉、頭孢替坦和氨苄西林完全耐藥,35株（83%）菌株對氨曲南耐藥；25株（60%）菌株對亞胺培南敏感,23株（55%）菌株分別對呱拉西林/他唑巴坦、妥布黴素和美洛培南敏感,17株（40%）菌株對慶大黴素和呱拉西林敏感。
2．4 耐藥基因檢測 在42株多重耐藥的鮑曼不動杆菌中,均檢測有TEM-1和ampC基因,5株（12%）檢測到ESBLs, 說明鮑曼不動杆菌對β- 內酰胺類抗生素有極高的耐藥性;38株（90%）多重耐藥菌均檢測到TEM-1、ampC、aac（3）和gyrA型基因;19株（45%）檢測有TEM-1、PER型基因。所有菌株均未檢出SHV、PER-1、VEB-1、IMP、VIM、OXA-23、OXA-24型基因（圖1）。表3 42株多重耐藥鮑曼不動杆菌的藥敏結果（略）
2.5 測序結果 將PCR型陽性擴增產物做雙向基因測序,並與GenBank
3 討論
3.1 本組鮑曼不動杆菌85%來自呼吸道標本，說明不動杆菌雖然是呼吸道的寄居菌，但在人體內成為優勢菌時，也能引起呼吸道感染，而且可導致多髒器、多係統感染,尤其容易發生於危急重症病人。大量廣譜抗生素的應用,使耐藥的鮑曼不動杆菌得到優勢生長,也成了鮑曼不動杆菌肺部感染的危險因素。
3.2 本組鮑曼不動杆菌對常用5大類 21種抗生素的平均耐藥率為59.8%和62.8%，對頭孢曲鬆等5 種頭孢菌素和氨苄西林的耐藥率幾乎達100%，對亞胺培南和美洛培南也有23.5%和38.3%的耐藥率，說明本組鮑曼不動杆菌產生了嚴重的多重耐藥性。
3.3 本組鮑曼不動杆菌對氨苄西林/舒巴坦加酶抑製劑的耐藥率為48.3%和49.5%，明顯低於氨苄西林100%的耐藥率。對呱拉西林/他唑巴坦加酶抑製劑的耐藥率僅為17.7%和15.2%，說明舒巴坦和他唑巴坦均能有效抑製β內酰胺酶。由於鮑曼不動杆菌對β內酰胺類抗生素的耐藥主要是產生β- 內酰胺酶，而且不動杆菌極易經質粒結合,並與多種耐藥質粒共存。可以是質粒介導的TEM - 1 和TEM - 2β-內酰胺酶,也可以由染色體介導的β- 內酰胺酶，或由於青黴素結合蛋白（PBPs） 的改變等原因導致耐藥。所以本組鮑曼不動杆菌對氨苄西林加舒巴坦後的耐藥率由100%降至48.3%，對呱拉西林加他唑巴坦後的耐藥率由54.4%降至17.7%。因此在對鮑曼不動杆菌感染的治療時,可選用加舒巴坦或他唑巴坦的β內酰胺類抗生素。不加酶抑製劑的抗生素已不適合臨床應用，不能作為經驗用藥。
3.4 鮑曼不動杆菌產生耐藥的機製比較複雜,且多重耐藥率很高，還能誘導革蘭陰性杆菌產ESBLs 與高產AmpC 酶的作用［4］。 在本組42株多重耐藥的鮑曼不動杆菌中,均檢測有TEM-1和ampC基因,5株（12%）檢測到ESBLs, 說明鮑曼不動杆菌對β內酰胺類抗生素有極高的耐藥性。尤其AmpC酶的普遍存和過量表達，表現出對β- 內酰胺酶極高的水解活性,可水解第三代頭孢菌素。由於AmpC酶為非誘導酶,無論誘導劑是否存在,均可高產此水解酶。所以在抗感染治療中，要嚴格禁止隨意使用第三代頭孢菌素，以防止或延緩各種高耐藥株細菌的產生與蔓延。
3.5 本組多重耐藥的鮑曼不動杆菌均產生氨基苷乙酰轉移酶［aac（3）-1 和aac（3）-2］,而普通株均不產該酶,說明aac（3）基因與鮑曼不動杆菌的多重耐藥有密切關係。另外,由gyrA和gyrB分別編碼的
3.6 本研究說明,鮑曼不動杆菌的多重耐藥與同時產TEM型廣譜酶,高產AmpC酶, aac（3）基因編碼的氨基苷乙酰轉移酶和gyrA基因編碼的DNA旋轉酶突變有密切關係。
作者：許景峰，徐 琳，樊衛紅《中華醫藥雜誌》
【參考文獻】
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4 Bou G,O liver A,M artinez-Beltran J. OXA-24, a novel classD beta-lactamase with carbapenemase activity in an Acinetobacter baumannii clinical strain. Antimicrob Agents Chemother, 2000, 44（6） :1556-1561.
