副豬嗜血杆菌病病原菌的分離與鑒定

副豬嗜血杆菌病病原菌的分離與鑒定，為預防該病， 國內外雖然研製了各種類型的基因工程菌苗與多價滅活菌苗，但由於副豬嗜血杆菌血清型眾多，各個地方的流行菌株各不相同，各個血清型之間的交叉保護性不高，菌苗的免疫效果並不理想。筆者對長治市某大型豬場的副豬嗜血杆菌進行了分離和鑒定，以便選擇針對性較強的菌株作為菌苗株，以起到更好的預防效果，並為副豬嗜血杆菌病的進一步研究奠定基礎。

 

副豬嗜血杆菌(Haemophilusparasuis)引起豬的多發性漿膜炎和關節炎，該病又稱為革拉澤氏病(Glasser’SDisease)，影響從2周齡到4月齡的青年豬，主要在斷奶前後和保育階段發病。通常見於5～8周齡的豬，發病率一般在10％～15％，嚴重時死亡率可達到50％。主要臨床症狀表現為咳嗽，呼吸困難，消瘦，跛行和被毛粗亂；主要剖檢病變表現為胸膜炎，心包炎，腹膜炎，關節炎和腦膜炎等。隨著世界養豬業的發展，該病已成為全球範圍內影響養豬業的典型細菌性疾病。由於飼養技術的調整以及突發新的呼吸道綜合征，使得該病日趨流行，危害日漸嚴重。近年來，隨著養殖水平的提高，副豬嗜血杆菌在我國各豬場引起多發性漿膜炎和關節炎的報道屢見不鮮，其損失相當慘重。

 

 

 

1材料與方法

 

1．1病料的采集對2個病死仔豬進行屍體解剖(應無菌操作)，打開胸腔和腹腔，首先吸取積液或以棉簽拭取胸膜及腹膜粘附物，然後再取內髒，內髒器官須實驗室無菌操作，以灼燒過的手術刀燙烙剖麵，取深層組織塗板培養。

 

1．2主要培養基本試驗選擇以下配方：胰蛋白腖0．6g、酵母浸出粉1．0g、可溶性澱粉0．25g、枸椽酸鈉0．15g、普通營養瓊脂粉4．5g。加蒸餾水至lOOmL，溶解後調pH至7．2～7．4，然後高壓上述混合物，120％，15min。在水浴中冷卻至80％。加10mL無菌脫纖綿羊血，在80％水浴中漩搖10～15min。在冷卻至50％時，加入無菌輔酶I(NAD)至15g／mL，加入萬古黴素至50g／mL。傾倒大約4mm厚平皿，冷卻後4℃保存備用。

 

1．3病原分離及純化從分離培養的瓊脂平板上挑取灰白或透明、光滑呈露珠樣的菌落，巧克力瓊脂平板單菌落劃線培養。48h後細菌塗片，革蘭氏染色鏡檢。如果為革蘭氏陰性小杆狀或多形性小杆菌，再進行一次巧克力瓊脂亞克隆培養，同時接種鮮血瓊脂平板和普通瓊脂平板。巧克力瓊脂平板生長良好，而鮮血瓊脂平板和普通瓊脂平板沒有菌落生成則菌株保存待進一步鑒定。經初步篩選的分離株CZ株。

 

 

 

1．4染色鏡檢挑取單個菌落進行革蘭氏染色，在光學顯微鏡下觀察細菌的形態特點。

 

1．5生化特性

 

1．5．1V因子需要試驗v因子為輔酶I即煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)，或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)，是細菌呼吸過程中起遞氫作用的兩種脫氫輔酶。挑取被檢分離株和副豬嗜血杆菌標準株菌落接種兔鮮血瓊脂平板和2％腖瓊脂平板上，再以金黃色葡萄球菌點種或垂直劃線，置37％培養48h。觀察葡萄球菌菌落周圍菌落生成情況，愈靠近金黃色葡萄球菌菌落生成的半透明菌落愈大，愈遠的愈小，甚至不見菌落生長，該現象即稱為“衛星現象”。

 

1．5．2X因子需要試驗x因子是血紅蛋白中的血紅素及其衍生物，含鐵卟啉，121℃高溫下30min不被破壞，是細菌合成細胞色素、細胞色素氧化酶、觸酶和過氧化物酶等的輔基。挑取被檢分離株和副豬嗜血杆菌標準株菌落接種2％腖瓊脂平板上，再分別貼上浸漬有x、V、X+V因子的圓形濾紙片。如果隻有含X+V因子的紙片周圍有菌落生長，則表明該菌株既依賴x因子又依賴V因子。如果隻有含V、X+V因子的紙片周圍有菌落生長，則表明該菌株隻依賴V因子不依賴X因子。

 

1．5．3生化實驗脲酶、葡萄糖發酵、樹膠醛糖發酵、乳糖發酵、甘露糖發酵、蜜三糖發酵、過氧化氫酶實驗等，采用以下培養基基質或者商品生化反應試劑加入以下特殊培養基成份。配方：BiosatePeptone(BBL)10mg、NaC110mg、酚紅0．04mg、高級瓊脂15mg、蒸餾水900mL。混合加熱溶解，冷後調節pH7．5後分裝於密封的瓶子內，121℃15min。這方法可用於大量或微量試驗。

 

2結果

 

2．1病原的分離及染色鏡檢CZ株為革蘭氏陰性小杆狀或多形性小杆菌，符合副豬嗜血杆菌的形態特征。

 

3討論

 

3．1在加抗菌素的選擇培養基上接種培養，用特殊的稀釋方法可以提高副豬嗜血杆菌的分離成功率5％CO!或蠟罐培養並不能提高副豬嗜血杆菌的生長速度，用脫纖維蛋白的血和胰蛋白腖血液瓊脂基質培養成分可以提高生長速度；用牛或羊血和胰酶水解酪蛋白瓊脂為培養基效果不佳。

 

3．2疾病發生時期，畜主多采州抗生素治療，效果往往不理想，其主要原因是副豬嗜血杆菌的耐藥性產生、毒素作用或多種病原混合感染。抗生素的使用給副豬嗜血杆菌的分離造成極大不便，使我們無法確認采集來的標本中是存在副豬嗜血杆菌。

 

3．3金黃色葡萄球菌等產色素的細菌及酵母茵在生長產過程中可合成v因子，並在培養基中擴散，滿足v子依賴性細菌的生長需求，所以出現衛星現象。衛星現象的產生可以用來鑒別剮豬嗜血杆菌的v因子依賴性。

 

3．4嗜血杆菌屬的多數細菌生長需要供給x子但副豬嗜血杆菌生長不需要x因子。如果隻有含V、X+V因子的紙片用有菌落生長，則表明該菌株隻依賴V因子不依賴x因子。本實驗中出現v因子依賴性的前提下，x因子依賴陽性的可以否定是副豬嗜血杆菌。

 

3．5南於副豬嗜血杆菌有較高的培養要求，其生化實驗的關鍵是特殊培養基基質的選擇，或者商品生化反應管的營養改良。m清、NAD等成份的加入可以保證副豬嗜血杆菌的培養成功，但是必須保證加入的成份不改變生化試劑的PH值等生化特性。