嗜水氣單胞菌分離株的鑒定與菌株腸毒素及致病性研究

【摘要】  　　目的對嗜水氣單胞菌進行鑒定並進行腸毒素檢測與致病性分析。方法 采用常規法分離培養，電子顯微鏡觀察形態,用法國梅裏埃VITEK32全自動微生物鑒定儀進行係統鑒定。乳鼠灌胃法測定熱穩定性腸毒素(ST),小白鼠腹腔注射法測定其毒力。結果檢出的嗜水氣單胞菌均產熱穩定性腸毒素(ST),具備較強的致病性。結論 分離的嗜水氣單胞菌具有較強毒力,與致病性密切相關。

【關鍵詞】  腹瀉；嗜水氣單胞菌；毒力；熱穩定性腸毒素

　　Identification of clinically isolated Aeromonas hydrphila and investigation of pathogenicity of its interoxin detected.

　　LI Gang-shan, FAN Quqn-shui, XU Qing, et al.

　　Institute for Medical Reseach of Chengdu Garrion Center for Disease Control and Prevention, Kunming 650032, Yunnan, P. R.China

   

　　Abstract：Objective  To identify the isloates of Aeromonas hydrophila clinically isolated and investigate the phathogenicity of its enterotoxin.  Methods  The isolates were cultured and observed under electron microscope and systemically identified with automatic bioassay device. The pathogenicity of enterotoxin was investigated by peritoneally injecting the enterotoxin into mouse.  Results  The Aeromonas hydrophila producing thermostatic enterotoxin is highly pathogenic.  Conclusion  Aeromonas hydrophila is associated with diarrhea.

    Key words：Diarrhea; Aeromonas hydrophila; Interoxixity; Thermostatic enterotoxin

    嗜水氣單胞菌(Aeromonas  hydrophila,以下簡稱Ah)廣泛分布於汙水、池水及河底土壤中,為革蘭陰性杆菌,是引起腹瀉的新病原菌。關於此菌的感染, 國外有較多報道, 而國內僅見有零星報道。近年來,我們對雲南邊防部隊感染性腹瀉進行病原監測,采集腹瀉患者糞便標本328份,在分離多種腸道病原菌的同時,從中分離出5株Ah,該菌經鏡檢、培養、法國梅裏埃VITEK32微生物全自動分析儀係統鑒定及電子顯微鏡下觀察予以證實,並對菌株進行了腸毒素及致病性研究，報道如下。

　　1.1 菌株來源 

　　從雲南邊防部隊感染性腹瀉患者糞便標本中分離。

　　1.2 分離培養 

　　將腹瀉患者糞便標本接種於SS瓊脂平板上置37℃孵箱培養18～24h，挑取可疑菌落進行純培養。

　　1.3 生化鑒定 

　　采用常規法和法國梅裏埃VITEK32全自動微生物分析儀NFC卡進行係統鑒定。

　　1.4 電子顯微鏡檢查 

　　將分離菌接種普通肉湯培養基,37℃培養18h, 2%磷鎢酸(PH6.4)負染製樣,用日立－2型電鏡檢查。

　　1.5 侵襲性測定 

　　采用豚鼠角膜試驗（Sereny  test）。

　　1.6 腸毒素測定 

　　采用乳鼠灌胃法測定熱穩定性腸毒素(ST)。

　　1.7 致病力測定 

　　15～18g健康小白鼠（購自昆明醫學院實驗動物中心）雌雄兼用，隨機分成試驗組和對照組，每組5隻，試驗組注射Ah肉湯培養物，每隻0.5ml,觀察小白鼠發病情況，對照組同法注射無菌肉湯，觀察7d。

　　1．8 藥敏試驗 

　　采用K-B紙片擴散法。藥敏紙片係北京天壇生物技術開發公司產品，在有效期內使用。

　　2.1 生物學特性 

　　在SS瓊脂平板上經37℃培養24h,其菌落形態為圓形，半透明、邊緣整齊、光滑、濕潤、微隆、直徑1～2mm。菌體形態為革蘭陰性杆菌，兩端鈍圓呈單或呈雙排列。在暗視野下觀察運動極為活潑，在電子顯微鏡下可見極端鞭毛（見圖1）。

　　2.2 係統生化鑒定

　　VITEK32全自動微生物分析儀NFC卡係統鑒定結果見表1。表1  分離的嗜水氣單胞菌生化特征試驗項目結果 （略）

　　2.3 侵襲力測定 

　　豚鼠角膜試驗陰性。

　　2.4 腸毒素測定 

　　經乳鼠灌胃試驗測試，分離的5株Ah腸/體之比均大於0.083,分別是0.091、0.105、0.087、0.123、0.096。證明產生較強的熱穩定性腸毒素（ST）。

　　2.5  致病力測定 

　　5株分離菌肉湯培養物分別腹腔注射小白鼠後，均在24h左右發病，表現為弓背、聳毛、運動遲緩、食欲不振，雙眼半閉、呼吸急促等症狀，72h內相繼死亡。解剖死亡的小白鼠，發現腸水腫，腸腔積液等，取腸內容物培養，仍獲原感染菌。注射無菌肉湯的對照組觀察7d無不良反應。

　　2.6 藥敏試驗 

　　在所試的12種抗菌藥物中 ，對9種敏感，1種中度敏感，3種耐藥，見表2。表2  分離的嗜水氣單胞菌藥敏試驗結果抗菌素紙片含量（略）注：S: 敏感； MS: 中度敏感； R：耐藥。

　　3.1 Ah是氣單胞菌屬中的細菌之一，該菌廣泛存在於水環境中，是一種人—畜—水生動物共患病病原菌。此類菌致病性決定於某些菌株的侵襲力、熱穩定性腸毒素和不穩定性腸毒素，該毒素和溶血素為氣單胞菌類主要致病因子［1］。該分離菌侵襲力測定為陰性，產熱穩定性腸毒素（ST），致病性測定有較強的致病力，與臨床症狀密切相關。我們從邊防部隊腹瀉病人糞便標本中分離出5株Ah，患者的主要臨床表現是：類似急性胃腸炎，症見腹瀉、嘔吐、腹痛，無發熱。Ah不僅感染動物，而且也是引起人類腹瀉的新病原菌。由於條件所限，未做不穩定腸毒素和溶血素測試。目前，國外已將Ah納入腹瀉病原菌的檢測範圍［2］。

　　3.2 氣單胞菌屬的細菌通常不產生賴氨酸脫羧酶，但與致病性有關的氣單胞菌賴氨酸脫羧酶陽性率較高，如本次分離的5株Ah賴氨酸脫羧酶均為陽性。對Ah的研究，國內很少有人用電子顯微鏡觀察其菌體形態，我們使用了較先進的電鏡對分離的Ah進行觀察，有助於對菌體結構的認識。使用先進的VITEK32全自動微生物分析儀對其菌株進行鑒定，具有快速、省事、省力且結果準確等優點。由於Ah的生化特性與腸幹菌科、弧菌屬、鄰單胞菌屬較為相似，沒有先進設備的基層單位，可利用氧化酶試驗、粘絲試驗、鳥氨酸脫羧酶和甘露醇、肌醇發酵等反應來鑒別。腹瀉病原感染因子的研究在臨床治療上具有重要意義，不同細菌的感染因子所需的首選藥物不盡相同，我們做的藥敏試驗，篩選出敏感、中度敏感、耐藥三類藥敏譜，對指導部隊和地方今後治療Ah的感染具有重要的指導意義。

 

作者：李剛山，範泉水，徐慶，周衛國，李作生，張富強，邱薇，張琳，王承珠，袁貴紅    《中國熱帶醫學》

 

［1］王秀茹. 預防醫學微生物及檢驗技術［M］.第1版.北京：人民衛生出版社，2002,353.

 

［2］楊守明. 嗜水氣單胞菌及其對人的致病性［J］.疾病控製雜誌，2006,10（5）：511～514.