致病性大腸埃希氏菌及其檢驗（3）

五、檢驗

致病性大腸埃希氏菌的檢驗應按《中華人民共和國國家標準——食品衛生檢驗方法(微生物學部分)》(GB489．6-84)的有關內容進行檢驗。

（一）、增菌培養

1、以無菌操作的方法稱取樣品25g，加入225ml營養肉湯培養基中，可用滅菌砂在研缽中磨碎或以均質器打碎樣品。

2、取適量接種於乳糖膽鹽培養基中，測定大腸菌群MPN，其餘移入500ml三角瓶中於36±1℃培養6小時。挑取一環，接種於一管30ml腸道菌增菌湯中，42℃增菌培養18小時。

（二）、分離培養

1、將乳糖膽鹽發酵陽性管液與增菌液分別劃線接種於麥康凱或伊紅美蘭瓊脂平板上。

2、於36±1℃培養18—24小時觀察菌落

對於汙染嚴重的食品可直接按劃線法接種，不經過增菌過程。

（三）、生化試驗

1、初篩試驗

選取在麥康凱或伊紅美蘭平板上發酵乳糖或不發酵乳糖的菌落5個以上，分別接種於克氏雙糖鐵、pH7.2尿素和阿拉伯糖中．經36C培養18～24小時，棄去H2S陽性或尿素酶陽性或阿拉伯糖陰性的培養物。

2、複篩試驗

把篩留下的培養物分別接種於緩衝葡萄糖蛋白腖和KCN培養基中，經36+1℃培養48小時，觀察生長結果並做V-P試驗，棄去V-P陽性及KCN陽性的培養物。

3、證實試驗

致病性大腸埃希氏菌屬除氧化酶陰性，革蘭氏陰性的特征以外，還有以下特性：葡萄糖產酸+，葡萄糖產氣+／一，乳糖產酸+90％，檸檬酸鹽—，尿素酶一，KCN-，V-P-，動力+或—，阿拉伯糖十，靛基質十95％：可按這些主化特性進一步證實其是否為致病性大腸埃希氏菌屬。

（四）血清學試驗

1、致病性大腸埃希氏菌血清學試驗

假定試驗：

從平板上選菌落生長稠密處挑取培養物，用致病性大腸埃希氏菌三種OK多價血清做玻片凝集試驗。不凝集的培養物可做陰性報告。

證實試驗：

2、侵襲性大腸埃希氏菌血清學試驗

在平板上菌落生長稠密處挑取培養物，用侵襲性大腸埃希氏菌診斷血清做玻片凝集試驗，侵襲性大腸埃希氏菌診斷血清包括兩種：OK多價血清和9種OK單價血清：

（五）、產腸毒素大腸埃希氏菌毒素試驗

1、動物試驗

將經過生化證實試驗的大腸埃希氏菌培養物接種肉湯管，於36+1℃培養24小時，3000轉／分離心30分鍾。取上清液用G6濾器過濾後分作兩份，一份加熱60℃30分鍾，供ST測定用，另一份不加熱，供LT測定用。

1）家免結軋回腸段試驗：

取體重為2kg的家兔，禁食使腸內容物排空。麻醉後剖腹，取出回腸段，按10～15cm為一段，分段結紮，取一段注射肉湯2mL作為陰性對照，另一段注射已知產毒菌肉湯培養物的上清液2ml作為陽性對照。其他各段分別注射待試菌株肉湯培養物的濾液2mL。將腹壁縫合。

測定LT時，於注射後18小時剖腹檢查

測定ST時，於注射後6—8小時剖腹檢查

取出腸管分別抽取腸段的積液，測定其容量，並測定腸段的長度。積液量(mL)與腸段長度(cm)之比大於l者為陽性。

2）乳鼠灌胃試驗：

2、雙向瓊脂擴散試驗

將被檢菌按5點環形接種於Elek氏培養基上，以同樣操作共做兩份，36±1℃培養48小時，在每株菌的菌苔上各放一片多粘菌素紙片，36+1℃經5—6時，使抗生素滲入瓊脂中，在五點環形菌苔各5mm處的中央，挖一個直徑4mm的園並用一滴瓊脂墊底。在一份平板的孔內滴加LT抗毒素30ul，另一份平板的孔內滴加ST毒素30ul。放於36+1℃經15～20小時觀察結果，在菌斑和抗毒素之間出現白色沉澱帶為陽性，無沉澱帶者為陰性。

（六）豚鼠角膜試驗

供測定侵襲性大腸埃希氏菌用，將經過生化證實試驗的待試菌株18—20小時瓊脂培養物，用肉湯洗下，使成每lml含菌9億個菌懸液，作為接種材料。

體重400--500g的健康豚鼠(角膜與結膜外觀正常，並經細菌培養檢查)的角膜上接種待試菌懸液1滴。

48小時後觀察結果，結膜充血浮腫、角膜混濁、眼內充盈淚液或漿液性分物者為陽性，自結膜囊取樣分離細菌，鑒定應與原接種菌一致。

（七）、結果報告

根據以上生化試驗、血清學試驗、腸毒素試驗和豚鼠角膜試驗的結果出報告，如果是產毒大腸埃希氏菌時應有腸毒素試驗的結果；如果是侵襲性大腸埃希氏蔭應有豚鼠角膜試驗和血清學試驗的結果；如果是腸致病性大腸埃希氏菌時應有血清學試驗結果。

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