微生物室常用的病原真菌檢查方法

1、真菌鏡檢

是最簡單也是很有價值的實驗室診斷方法。其優點在於簡便、快速，無菌部位的陽性結果可直接確定真菌感染。但是由於陽性率較低，陰性結果亦不能排除診斷。直接鏡檢對於淺表和皮下真菌感染最有幫助。在皮膚刮屑、毛發或甲標本中發現皮膚癬菌、念珠菌和馬拉色菌的成分可提供對相應真菌病的可靠診斷。如在無菌體液的 直接鏡檢中發現真菌成分常可確立深部真菌病的診斷，例如在腦脊液中檢測到帶莢膜的新生隱球菌酵母細胞，或外周血塗片中檢測到莢膜組織胞漿菌細胞。但一般在有菌部位則隻有發現大量真菌菌絲方才有意義，通過直接鏡檢一般可以區分念珠菌、隱球菌、暗色真菌、毛黴（接合菌）等菌的感染，進一步明確鑒定菌種需要通過 培養鑒定來完成。

2、真菌培養

真菌培養是實驗室檢查中的重要環節，培養出致病真菌是進一步鑒定菌種的前提條件。真菌培養第一步是從臨床標本中培養真菌的初代培養，初代培養後進一步進行分離純化培養和鑒定培養。不同致病真菌每一步所采用的培養基，培養時間和培養溫度存在一定的差異。常規的真菌培養需要在28-30°C溫度下培養3-4 周，一般初代培養選用沙氏培養基（SDA）或者馬鈴薯瓊脂培養基（PDA），采用試管培養，一般同時培養兩管，其中一管可添加抗生素（氯黴素或慶大黴素均 可）。在培養1周內，應該每天觀察有無真菌生長。一般培養4周後，如果無真菌生長可報陰性。發現培養出真菌，直接挑取少量菌體或者小培養後，用乳酸酚棉蘭製成塗片顯微鏡下觀察，結合菌落大體形態，典型菌種可直接報告種屬。不典型菌種根據基本表現，采用適當的標準鑒定培養基，標準培養條件培養，必要時要結合 生理學和分子生物學方法進行鑒定。

    3、真菌鑒定

    對常見致病真菌要掌握的鑒定原則是首先區分酵母菌和黴菌。

    如果初代培養基上培養出酵母樣菌落，在鑒定前應進行分離純化。在去除細菌和其他真菌汙染，區分混合感染後，對純菌落進行鑒定。酵母菌鑒定主要根據形態學特征和生理生化特點，按照一定的流程進行。首先根據菌落顏色進行分類。臨床最為常見的是白色或奶白色菌落，這類菌進一步做芽管試驗，若芽管試驗是陽性則為白 念珠菌，若陰性則通過Vitek YBC或API20C及玉米吐溫瓊脂上培養的形態特征來鑒定。另外，還可以應用念珠菌顯色瓊脂、尿素酶試驗等試驗來輔助鑒定。

    黴菌的鑒定非常複雜，有許多標準包括形態學特征、溫度耐受性，放線菌酮抗性、雙相性、營養需求、蛋白分解活動以及水解尿素能力等。現代分類學鑒定方法主要依據分生孢子的個體發生過程結合其他特征來進行鑒定。初代培養後根據形態學特征一般可鑒定到屬的水平，再依據不同真菌的鑒定要求，采用標準培養基和培養條 件進一步完成菌種鑒定。例如：曲黴屬鑒定時需要采用標準培養基，即察氏培養基和麥芽瓊脂，25℃培養7天後與曲黴形態鑒定檢索表對應得到正確的結果。

    （一）形態學鑒定

    1、菌落形態觀察  致病真菌的形態學鑒定的第一步就是要區別不同的菌落特征。即酵母型菌落或絲狀型（黴菌）菌落。對黴菌通常采用形態學鑒定為主, 而酵母菌常需采用形態和生理相結合的手段。觀察真菌菌落時應注意菌落大小、形態、色素、顏色和質地。

    2、顯微鏡檢查  為充分在鏡下觀察真菌結構，必須用分離針挑出一部分菌落進行觀察。常用乳酸酚苯胺藍(LPCB，棉藍)對挑取的部分菌落進行染色。此項操作必須在生物安全櫃中進行。樣本需要保存時可用指甲油封邊。小培養、覆蓋培養、透明膠帶法等均是常用的方法。

    3、玻片培養  是一種特殊的玻片作成的培養小室，可以更為清楚地觀察真菌孢子和分生孢子的形成及位置。涉及小培養的所有操作均應在生物安全櫃中進行。可選用馬鈴薯瓊脂、玉米瓊脂或V-8果汁做培養基。

    4、透明膠帶法  用透明膠帶粘取菌落表麵置於鏡下觀察，是一種不破壞分生孢子結構的快捷方法。

    5、電鏡觀察  透射電鏡(TEM)用來觀察真菌的斷麵，橫隔的差別、各種細胞器、細胞壁等結構。掃描電鏡（SEM）用來觀察真菌的表麵結構，特別是產孢特點。

 

    用表型特征對真菌進行分類鑒定，仍然是目前臨床實驗室普遍應用的方法。對致病真菌的鑒定，需要選擇合適的培養基進行培養後，再借助光學顯微鏡，加上熒光顯微鏡、電子顯微鏡和細胞化學等各種染色法觀察形態特點。

    （二）分子生物學鑒定

    應用分子生物學技術從遺傳和進化角度闡明真菌菌種之間和種間內在關係是目前真菌分類研究熱點，已普遍應用於真菌現代分類鑒定之中。

    常用的分子生物學鑒定方法包括：真菌DNA 鹼基組成（G+C Mol%）、限製性片段長度多態性（RFLP）、隨機擴增多態性DNA（RAPD）、Southern 印跡、脈衝場凝膠電泳（PFGE）、rDNA序列測定等。由於生物多樣性的緣故，分子生物學的研究有4種目的：①係統發生研究；②分類學研究，主要在屬、種水平；③鑒定應用，即決定明確的分類名稱；④流行病學和群體的遺傳學研究。

DNA序列測定是目前最引人注目的發展方向，已成為致病真菌的分類鑒別的重要手段。目前應用最多的為rDNA序列、幾丁質合成酶、細胞色素P450 L1A1基因，細胞色素氧化酶C和細胞色素B等基因序列。 

    （三）生理學和生物化學方法  在純培養上真菌生長比較快，可以使用生理、生化方法來鑒定菌種，多用於酵母菌的鑒定。測定真菌的不同生長溫度的溫度試驗也用於鑒定。對碳水化合物的利用能力是酵母菌鑒定的主要手段，目前已有商品化的API係統，也可用於絲狀真菌的輔助鑒定。

 

    此外，微生物自動鑒定係統Vitek、autoSCAN-4、Biolog和MIS等自動鑒定係統，可以較滿意地鑒定臨床上常見的病原性酵母菌。   

    雖然經典檢查方法是真菌檢查的基礎，雖然操作簡便但存在著敏感度低，耗時長等不足。近年來，除經典的真菌學方法以外的非培養檢查方法在真菌感染診斷，特別是侵襲性真菌病方麵發揮了重要作用。這些方法主要包括血清學檢查、和分子生物學檢查等。     1、血清學方法檢測真菌抗原成分

    念珠菌感染和曲黴感染的血清學檢測可分為抗體檢測和抗原檢測兩大類；由於發生侵襲性真菌病的免疫受損宿主往往缺乏可檢測到的抗體，或者抗體的產生變化較大，因此檢測抗體對於係統性真菌感染的診斷意義不大，而目前用於臨床的血清學檢查主要屬於後者，即檢測血液循環中的抗原；常用的有下述幾種：

    （1）、β-D-1,3葡聚糖（BDG）：是許多真菌細胞壁的主要成份，如念珠菌、曲黴、鐮刀菌等，但不包括隱球菌和接合菌；由於細菌、病毒、哺乳動物無這種成份，因而在循環血液中測得時則提示侵襲性真菌感染，目前已經有商品化BDG檢測的試劑盒。BDG的檢測，在2小時內可以獲得結果，因此盡管不能區分 真菌感染的種類，但是仍然具有重要作用，美國FDA已經批準Fungitell用於真菌感染的診斷，國內也有相似試劑問世，目前在臨床應用中。

    （2）、半乳甘露聚糖（GM）：GM是存在於曲黴和青黴細胞壁的一種熱穩定的多糖，可用於侵襲性曲黴病的臨床診斷。可以使用血清和支氣管肺泡灌洗液檢測 GM，近來也有人使用尿液和腦脊液等標本檢測。GM檢測的敏感性為29-100%，而其特異性可超過90%。由於GM量的多少與組織中真菌含量密切相關， 因此檢測GM還可以提示疾病的預後。

    2、分子生物學檢測：

    由於真菌培養和鑒定需要的時間較長，陽性率較低，因此與分子生物學相關的從臨床標本直接檢測真菌的技術和方法也在不斷發展中，最為活躍的當屬PCR技術， 具有快速、敏感等特點。PCR技術可以擴增血清、血漿、全血、尿液、痰液、支氣管肺泡灌洗液和膿液等標本中的真菌成份。在進行擴增之前，應當對標本進行處理以去除影響擴增效率的一些因子。所擴增的靶序列有多種，但是應用較多的還是 rDNA的ITS1和ITS2區域；與培養相比，ITS-PCR檢測血標本中念珠菌的敏感性與特異性可以達到100%。在PCR擴增檢測中，有傳統的 PCR方法，也有巢式PCR法，最近應用較多的是實時定量PCR方法，其敏感性和特異性較好，在臨床有應用前景