SN 0184-93 出口食品中單核細胞增生李斯特氏菌檢驗方法
Method for the examination of Listeria monocytogenes in food for export
樣品:冷凍樣品,2-5℃解凍,不超過18h
若不能及時檢驗,應置於-15 ℃保存。
非冷凍易腐樣品應盡可能及時檢驗。
若不能及時檢驗,應置於4 ℃冰箱保存,在24h之內檢驗。
兩次增菌:
巴氏消毒乳、乳製品、冷凍水產品、凍肉及其它加工食品應該前增菌。
25g+225ml改良緩衝蛋白腖水,均質。
30 ℃培養18-24h,移取1ml接種於100ml增菌培養液(EB)中,30 ℃培養24、48h,分別進行分離。
直接增菌:
生乳、鮮肉以及未經加工處理過的樣品。
25g+225ml 增菌培養液,30 ℃培養24和48h,分別進行分離
分離:
劃線接種於MMA或者OXA平板,35 ℃培養24-48h。
斜射光鏡檢。
MMA平板:藍色或者蘭灰色,扁平圓潤,稍有凸起,邊緣整齊 ,菌落較小,約為0.5mm左右
OXA平板: 菌落呈黑色,直徑1mm,在其周圍形成一個黑色環。
從MMA或OXA上挑取5個可疑菌落,接種TSA-YE平板,進行純培養。
純化菌落再轉接到TSB-YE肉湯,35℃培養24h。
進行生化試驗。
典型運動鏡檢:
從TSA-YE平板挑取生長良好的菌落於潔淨載玻片上。
用0.85%滅菌生理鹽水製成懸浮液。
在顯微鏡下用油鏡觀察。
短棒狀杆菌,顯微鏡下可見輕微旋轉和翻滾。
過氧化氫酶:
過氧化氫酶又稱接觸酶,能催化過氧化氫分解成水和氧。
菌落-平板-1滴3%的過氧化氫。陽性。過氧化氫酶實驗也可以在試管中進行。
革蘭氏染色鏡檢: 革蘭氏陽性
溶血試驗:
7%羊血瓊脂平板,劃分小格,刺種菌落。做陽性對照和陰性對照(英諾克李斯特氏菌)。
35 ℃培養24-48h,於明亮處觀察。
單核細胞增生李斯特氏菌在刺種點產生窄小的透明β溶血環。
尿素酶(Urease)試驗:
有些細菌能產生尿素酶,將尿素分解、產生2個分子的氨,使培養基變為堿性,酚紅呈粉紅色。
穿刺接種尿素酶瓊脂斜麵,35℃培養5天,逐日觀察,陰性。
硝酸鹽還原試驗:
某些細菌能夠把培養基中的硝酸鹽還原為亞硝酸鹽。
亞硝酸鹽與乙酸反應生成亞硝酸。
硝酸與對氨基苯磺酸作用,形成偶氮苯磺酸。
偶氮苯磺酸與α萘氨結合,形成紅色的N-α苯氨偶氮苯磺酸
接種硝酸鹽肉湯,35℃培養5天,
加入0.2ml試劑A,再加入 0.2ml試劑B,輕搖混合。
紅色:陽性
沒有顏色變化:加入少量鋅粉
-變紅-陰性(硝酸鹽未被還原)
-不變-陽性(亞硝酸鹽已經分解成氨和氮)
三糖鐵(TSI)瓊脂試驗:
本試驗可同時觀察乳糖和蔗糖發酵產酸或產酸產氣(變黃);產生硫化氫(變黑)。葡萄糖被分解產酸可使斜麵先變黃,但因量少,生成的少量酸,因接觸空氣而氧化,加之細菌利用培養基中含氮物質,生成堿性產物,故使斜麵後來又變紅,底部由於是在厭氧狀態下,酸類不被氧化,所以仍保持黃色。
三糖鐵試驗:
接種三糖鐵瓊脂,35℃培養5天。
斜麵和底層產酸,不產生硫化氫。(發酵葡萄糖和蔗糖)
糖酵解試驗:
不同微生物分解利用糖類的能力有很大差異,或能利用或不能利用,能利用者,或產氣或不產氣。可用指示劑及發酵管檢驗。
接種0.5%糖類發酵管。
35℃培養24-48h,陰性繼續培養到5天。李斯特氏菌不產氣。
葡萄糖:陽性
麥芽糖:陽性
七葉苷:陽性
甘露醇:陰性
鼠李糖:陽性
木糖:陰性
動力觀察:
穿刺接種半固體動力培養基,
室溫(20-25℃)培養2-5天,逐日觀察。
有動力。
自穿刺線向四周蔓延生長,
呈典型傘狀生長,底部為彎月牙狀。
協同凝血試驗:企業可不做。
血清學檢驗:企業可不做。
小鼠毒力試驗:企業可不做。
結果報告:
陽性結果:檢出單核細胞增生李斯特氏菌
陰性結果:未檢出單核細胞增生李斯特氏菌
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