複方羊角片微生物限度檢查法方法學驗證試驗研究

【摘要】  方針：建樹複方羊角片微生物限度搜檢體例。體例：接納低速離心沉澱集菌與造就基稀釋聯用法、造就基稀釋法、通例法。功效：稀釋劑鬥勁組和試驗組的菌接納率均年夜於80%：陰性鬥勁組未檢出陰性鬥勁菌，試驗組檢出陽性試驗菌。結論：可以用該微生物限度搜檢法進行複方羊角片的搜檢。

【關頭詞】  複方羊角片；低速離心沉澱集菌法；造就基稀釋法

Verification Test on the Technology of Microbial Limit Test　for Compound Yangjiao Tablets

　　Li Yeifeng，et al

　　Heilongjiang Renhetang Pharmaceutical Co.，Ltd(157011)

　　Abstract：Objective：To establish microbial limit test method for Compound Yangjiao Tablets.Methods：Verification test was carries out by integrated twomethods，collecting bacteria with low-speed centrifugation and nutrient medium dilution method：nutrient medium dilution method：common method.Results：The recovery rates of thinner control group and trial group are all more than 80%：The negative control group does not pick out negative bacteria control，trial group checks up positive bacteria.Conclusion：The microbial limit test method can be used dy  Compound Yangjiao Tablets.   

　　Key words：Compound Yangjiao Tablets；the method of collecting bacteria with low-speed centrifugation；Nutrent medium dilution method

　　複方羊角片係由羊角、川芎、白芷、製川烏等藥材製成的複方製劑，為偏頭痛，血管性頭痛，彌留性頭痛，神經性頭痛的常用藥。主要身分川芎、白芷都有抑菌浸染，按通例體例測定其微生物限度無法確保功效的切確性，體例驗證是保證功效切確的獨一路子。

　　1  工具

　　1.1  儀器   

　　電熱恒溫幹燥箱、電熱恒溫造就箱、高壓蒸汽滅菌鍋、低速自動平衡離心計心情、淨化事情台等。

　　1.2  樣品    　　

　　複方羊角片（黑龍江仁合堂藥業有限責任公司，批號：20090301）。

　　1.3  造就基   

　　營養瓊脂造就基、玫瑰紅鈉瓊脂造就基、膽鹽乳糖造就基、4-甲基傘形酮葡糖苷酸（MUG）造就基、改良馬丁造就基、曙紅亞甲藍瓊脂（EMB）造就基，均購自中國藥品生物製品檢定所。造就基的製備按幹燥造就基瓶簽標示體例配製及滅菌。

　　1.4  稀釋劑   

　　pH7.0無菌氯化鈉-卵白腖緩衝液、0.9%氯化鈉溶液。按中國藥典2005年版一部附錄體例配製及滅菌。

　　1.5  菌種   

　　金黃色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、年夜腸埃希菌，白色念珠菌、黑曲黴菌均泉源於中國藥品生物製品檢定所。   

　　2  體例

　　2.1  菌液製備  分袂接種年夜腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的奇異造就物至營養肉湯造就基中，於32℃造就24h；接種白色念珠菌的的奇異造就物至改良馬丁造就基中，於25℃造就48h，分袂取各菌種造就液1ml用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋，分袂取1ml 10-5、10-6和10-7稀釋液至平皿中，傾瀉營養瓊脂造就基，造就48h，計數；接種黑曲黴菌的奇異斜麵造就物，用0.9%無菌氯化鈉溶液5ml將孢子洗脫，羅致此溶液1ml用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋，分袂取1ml 10-5、10-6和10-7稀釋液至平皿中，傾瀉玫瑰紅鈉瓊脂造就基，造就48h，計數。拔取菌落數為50～100cfu的響應稀釋級的造就液，保留備用。

　　2.2  供試液製備  稱取樣品10 g，研細，加pH7.0無菌氯化鈉-卵白腖緩衝液至100 ml，製成 1∶10供試液。

　　2.3  細菌總數、黴菌及酵母菌總數搜檢體例的驗證

　　2.3.1  試驗組  ①細菌：取劃定量供試液，離心（500r/min）5min，取全數上清液加pH7.0無菌氯化鈉-卵白腖緩衝液補至原量，再離心（3000r/min）20min，取舍上清液，留底部菌液約2ml，加pH7.0無菌氯化鈉-卵白腖緩衝液補至原量混勻，根據2005版藥典微生物限度造就基稀釋法（0.2ml/皿）磨練；②黴菌及酵母菌：取劃定量供試液，根據2005版藥典微生物限度造就基稀釋法（0.2ml/皿）磨練。

　　2.3.2  菌液組  測定所加的試驗菌數。除不加供試液外，操縱同試驗組。

　　2.3.3  供試品鬥勁組測定供試品本底菌數。除不加菌液外，操縱同試驗組。

　　2.3.4  稀釋液鬥勁組測定稀釋液是否幹擾微生物發展。取稀釋液 l ml，別的同試驗組。   

　　三次試驗功效見表1、表2、表3。   

　　第一次試驗功效：   

表1  細菌、黴菌及酵母菌數驗證試驗（略）

　　第二次試驗功效：   

　　表2  細菌、黴菌及酵母菌數驗證試驗（略）

　　第三次試驗功效：   

　　表3  細菌、黴菌及酵母菌數驗證試驗（略）

　　2.4  節製菌搜檢體例的驗證

　　2.4.1  試驗組  取1∶10供試液10ml，加膽鹽乳糖造就基100ml，再加陽性鬥勁菌年夜腸埃希菌菌液（濃度同細菌、黴菌及酵母菌數驗證）1ml，搖勻，置35～37℃造就24h後作 MUG試驗及靛基質試驗。操縱MUG造就和靛基質試驗對年夜腸埃希菌進行造就檢測。年夜腸埃希菌濃度同細菌、黴菌及酵母菌數驗證。

　　2.4.2  陰性菌鬥勁組  體例同試驗組，金黃色葡萄球菌菌液（濃度同細菌、黴菌及酵母菌數驗證）l ml庖代年夜腸埃希菌。同時作稀釋液和造就基陰性鬥勁。   

　　三次功效均齊截，見表4。   

　　表4  節製菌驗證試驗功效（略）

　　注：如MUG陽性、靛基質陽性，果斷試驗品檢出年夜腸埃希菌；如MUG陰性、靛基質陰性，果斷試驗品未檢出年夜腸埃希菌。   

　　3  功效

　　3.1  細菌總數、黴菌及酵母菌總數搜檢體例驗證5種菌株的接納率均高於80%（表1、表2、表3），合適驗證劃定。稀釋劑鬥勁組的接納率（%）=（稀釋劑鬥勁組平均菌落數/菌液組平均菌落數）×100%；試驗組的接納率（%）=［（試驗組平均菌落數-供試品鬥勁組平均菌落數）/菌液組平均菌落數］×100%。

　　3.2  節製菌搜檢體例驗證試驗組陽性菌鬥勁檢出年夜腸埃希菌，陰性菌鬥勁未檢出年夜腸埃希菌（表4），說明本法可檢出年夜腸埃希菌，具有專屬性，合適驗證劃定。   

　　4  談判

　　4.1  在建樹測定體例時應詳盡某些供試品具有抑菌活性，概略影響磨練功效的切確性，必需對供試品的抑菌活性及測定體例的靠得住性進行驗證。

4.2  若EMB平板上發展的菌落與年夜腸埃希菌形態疑似，應挑取可疑菌落進行渙散、純化、染色鏡檢和IMViC試驗，確認年夜腸埃希菌。 

來源：《黑龍江醫藥》 

【參考文獻】

  　　［1］ 中華人平易近共和國國家藥典委員會.中國藥典［S］.一部.北京：化學財產出版社，2005.附錄73.

　　［2］ 黃小靜.4種丸劑微生物限度搜檢法體例驗證［J］.海峽藥學，2008，20（6）：75-77.

［3］ 宋勤，袁林娜，劉應旭.口服頭孢拉定製劑微生物搜檢法研究試驗［J］.藥物剖析雜誌，2005，25（6）：689-691.

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