細胞培養汙染的途徑、危害及預防措施（下）

　2.3.2　危害　支原體通過產生代謝產物及消耗各種養分，如核酸前體及必需氨基酸，從而改變細胞的代謝狀態。支原體可以酵解糖，分解精氨酸，氧化丙酮酸，解脲支原體可以利用尿素作為能源，這會使細胞代謝發生一係列改變，從而影響蛋白質、DAN、RNA合成以及嘌呤從頭合成及補償合成途徑。汙染時間的長短及核酸代謝改變決定了支原體汙染造成的危害程度，導致細胞染色體斷裂、重排、非整倍體的出現。隨後，細胞的生長特性發生改變，使某些酶和細胞因子的產生增加，並表現出一些特殊的細胞功能，而其它一些細胞正常的功能則被抑製。某些支原體附著在細胞表麵後，會與宿主細胞交換膜抗原成分。隨著細胞膜成分的改變，細胞的形態及抗原性發生改變。細胞汙染對研究工作帶來的最大危害是由於錯誤的實驗結果導致研究誤入歧途。此外，支原體汙染還會幹擾細胞的篩選，如雜交瘤細胞生長受到抑製並喪失產生單抗的能力（附表）。

^*HAT：次黃嘌呤-氨基喋呤-胸腺嘧啶核苷係統

　　2.3.3　預防及控製　汙染發生後首先應確定汙染物的種類及汙染的程度。為了能正確檢測細菌或支原體的汙染，應先撤去培養液中的抗生素。常規細胞傳代培養中應用抗生素會導致：①掩蓋了不很嚴重的汙染；②導致了耐藥菌的產生。每一種抗生素的抗菌譜都是有限的，而且許多抗生素僅是抑製細菌生長，而非殺菌劑。因為支原體無細胞壁，所以青黴素，頭孢菌素等幹擾細胞壁合成的抗生素對於支原體無效。

　　菌檢及支原體檢測隻有在撤去抗生素後才能進行。實驗中若發生汙染或其它問題應有詳細的記錄，並由經驗豐富的專家分析，找出哪個環節出了問題，包括培養液的配置、實驗室環境的保持和無菌操作過程等，從而不斷完善操作規程，避免類似問題的出現。此外，管理者還應製定細胞培養的各項規章製度，教育每一個實驗人員遵守。實驗室負責人應根據情況，製定修改各項規範的操作程序及人員培訓計劃。一般來說，隨著實驗室規模的擴大，細胞發生變異和汙染的可能性增加了^［5］。因此，大型實驗室應嚴格製定各項操作程序及規章製度。細胞培養中無菌操作需要清潔的工作環境、實驗的合理安排、實驗者熟練的操作技巧及強烈的責任感。隻有通過不斷地學習、訓練，才能熟練掌握無菌操作技術。

　　為了盡可能減少汙染的發生，以常規檢查的方式來監督是必要的。細胞培養中發生汙染是不可避免的，我們的目的是盡可能減少汙染的發生及危害。根據美國實驗室的調查報告顯示，至少10％的細胞係存在支原體的汙染^［2］。一旦發生汙染，如果細胞有詳細的記錄，則汙染引起的危害較小。我們可以根據細胞定期菌檢記錄，拚棄最後一次細胞菌檢陰性後的實驗結果。利用菌檢陰性的細胞重新開始實驗。如果僅偶爾進行菌檢或采用非特異檢測方法，尤其是支原體汙染，那麽確定汙染的範圍比較困難。因為所有的細胞係都有可能被交叉汙染。一旦發生汙染，所有未進行菌檢的凍存細胞都必須進行菌檢，以去除汙染的細胞並明確汙染發生的時間。

　　2.3.4　檢測　由於支原體汙染並不引起細胞外觀的明顯變化，故常規的支原體檢測非常必要的。人們可利用一係列直接或間接的方法檢測支原體。但由於支原體種類的多樣性，目前還沒有一種方便、廣譜、特異性高、準確的檢測方法。因此，有必要對不同檢測方法的靈敏度及局限性有所了解。

　　不同檢測方法對送檢標本的要求不同，如果標本不合格，將不可能獲得正確的結果。血清、培養液或培養基附加成分在加工和儲存過程中汙染會在一定程度上被稀釋，影響檢出率^［6］。間接檢測法由於其敏感性較差，若不采用濃縮標本，則不適用於檢測血清和培養液的汙染。由於汙染物的隨機分布，因此僅進行一次檢測通常會出現假陰性^［1］。如果標本中汙染物濃度低於10個汙染物／ml，隨機抽取1ml標本進行檢測可能有36.6％的假陰性率。增加標本體積，濃縮標本有助於降低假陰性率。另一種假陰性的產生是由於汙染物在試劑瓶，凍存瓶等容器中的分布不均所致。若20個樣品中有一個被汙染（5％的汙染率），檢測所有20個樣品，假陰率為36.6％。需要指出的是，僅僅單次檢測一個標本來判斷有無生物性汙染的作法是不可靠的。因此，在分裝液體前，就應當從原液中盡可能多取一點液體進行檢測。如果不能做到這一點，則應該用標準方法選擇多個標本進行檢測。例如，在無菌過濾操作中，隨著濾過體積的增大，濾膜破損的可能性增加，故應選擇最後過濾的液體進行檢測。

　　標本的處理與標本的選擇同樣重要。各種酶如胰酶、脂酶，強酸，強堿或其它化學物質會破壞支原體膜的脂質，使支原體喪失活力及膜的完整性。膜的完整性被破壞後，支原體內的蛋白酶及核酶釋放，從而會幹擾間接檢測方法的結果。如果標本收集後不能當天檢測，則應該盡快凍存標本以防止降解。選擇、處理檢測標本的目的是盡可能發現潛在的汙染。在細胞培養過程中就應考慮到支原體汙染的檢測。我們最好選用無抗生素培養，檢測應盡可能離傳代時間長一點，以便讓任何潛在的汙染物生長、繁殖。為防止支原體活力喪失，如果檢測的是貼壁細胞，應采用刮除細胞的方法，因為胰酶或其它生化分離方法會降低支原體的活性。

　　在選用合適的檢測方法時，應考慮到支原體的滴度和活力這兩個因素。直接培養法是最敏感的，但也是最耗時的檢測方法，大約需28天。從理論上講，隻需一個有活力的支原體就能在培養基上生長。但某些難以培養的支原體限製了直接培養法的應用。理想的直接培養法應采用多功能的培養基，以降低假陰性率^［7］。為增加對低滴度和低活力支原體檢出率，應采用有氧和無氧兩種培養條件及幾種傳代方式。直接培養法還需要活性支原體作為陽性對照，而且耗時，操作繁瑣，因而不適於大多數實驗室。

　　檢測支原體汙染的間接法包括：PCR、ELISA、電子顯微鏡檢查、DNA探針、DNA熒光染色及生化分析法等。間接法能檢測到10⁷／L的滴度。通常情況下，支原體汙染後其滴度一般超過10⁹／L，故盡管間接法不敏感，但相對較精確。由於支原體的多樣性，表達不同特異性的抗原及酶，為生化及免疫檢測法帶來技術上的困難^［8］。在選擇PCR、DNA探針等方法前，應考慮好選擇合適的靶序列及引物序列。

　　DNA熒光染色法和直接培養法相結合是支原體檢測的金標準^［5］。美國、加拿大、日本和歐共體國家生物製藥及診斷的監督機構推薦使用這種方法。其基本原理在於利用不同的技術，多次檢測，以彌補各種檢測技術的缺陷，增加檢測結果的可信度。

　　2.3.5　控製及排除　控製支原體汙染或其它生物性汙染的唯一可靠的方法是所有可能汙染的物品用高壓蒸氣滅菌法消毒。所有細胞培養設備都應消毒，應嚴格遵守上述的各項規章製度及監督製度，直至所有潛在的汙染源都被消除。

　　細胞一旦被支原體汙染，要將它清除是非常困難的。由於一些不可複得的細胞被汙染，人們不得不設法清除汙染，挽救一些珍貴的細胞。事實上，經支原體汙染的細胞，在汙染經處理被清除後，細胞原有的許多生物學特性，如基因的表達，抗原性和代謝特點也隨之發生了相應的改變。排除支原體汙染的方法，包括使用抗生素、抗血清、裸鼠體內接種、巨噬細胞吞噬、胰酶消化等方法，但沒有一種方法是普遍有效的。所以在采用每一種方法時必須對其效果，以及對細胞可能產生的毒性影響進行監測。Del Guidice和Gardella^［6］提出了一個有效的方法，其基本步驟包括首先分離、鑒定汙染物及測定對抗生素的敏感性，然後使用至少兩種敏感的抗生素進行處理。為增加排除汙染的有效性，可以通過稀釋以降低血清及其它促生長因子的濃度，從而降低細胞的密度。治療後細胞應在無抗生素條件下培養若幹代，以確定汙染已被徹底清除。細胞培養過程中支原體汙染不易察覺，細胞被支原體汙染後清除非常困難，支原體汙染的細胞在支原體被清除後，其細胞特性會發生很大改變，對研究結果造成嚴重影響。因此，為了保證細胞培養體係免受汙染的影響，關鍵是加強預防措施。

　　作者簡介：李穎健　(南京大學醫學院博士研究生)

　　參考文獻

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