【摘要】 目的研究麻瘋樹提取物的體外抗病毒和殺菌作用，為進一步提取分離有效成分提供實驗依據。方法采用細胞培養技術，觀察麻瘋樹1，2，3號提取物對單純皰疹Ⅰ型病毒（HSV-Ⅰ）、單純皰疹Ⅱ型病毒（HSV-Ⅱ）和流感A3型病毒（A3）的直接滅活作用以及抑製它們增殖的作用；采用懸液定量殺菌法，觀察麻瘋樹1號提取物對白色念珠菌、金黃色葡萄球菌和大腸杆菌的殺滅作用。結果麻瘋樹1，2，3號提取物對細胞的毒性較小；提取物既能抑製單純皰疹病毒在胞內的增殖，又能直接滅活該病毒；總體而言，提取物對HSV-Ⅰ在胞內增殖的抑製作用略優於HSV-Ⅱ，對HSV-Ⅰ的直接滅活作用更是顯著強於HSV-Ⅱ；提取物對A3的直接滅活作用效果顯著；3號提取物還能抑製A3在雞胚內的增殖。麻瘋樹1號提取物對白色念珠菌、金黃色葡萄球菌和大腸杆菌具有極強的殺滅作用。結論麻瘋樹提取物具有體外抗病毒、殺菌的作用。
【關鍵詞】 麻瘋樹 提取物 抗病毒 殺菌
Abstract：ObjectiveTo provide an experimental evidence for further extraction and separation of active components, we investigated the antivirus and bactericidal effects of extracts from Jatropha curcas L. in vitro. MethodsWe applied the method of cell culture to observe extracts from Jatropha curcas L., No.1,2,3, directly killing herpes simplex virus (HSV-Ⅰ&Ⅱ) and influenza virus A3, as well as inhibiting their proliferation in cells. In another experiment, we observed the bactericidal effect of No.1 extract from Jatropha curcas L. on Candida albicans, Staphylococcus aureaus and Escherichia coli. ResultsThe extracts from Jatropha curcas L., No.1,2,3, had lower cytotoxicity. All the extracts could inhibit herpes simplex virus from proliferating in cells and directly kill the virus. Their inhibitory action on the proliferation of HSV-Ⅰwas a little better than Ⅱ, while their inhibitory effect on HSV-Ⅰwas obviously stronger than Ⅱ. All the extracts were able to kill influenza virus A3 directly, and extract No.3 could inhibit the proliferation of this virus in embryonated egg. Furthermore, No.1 extract had a very strong bactericidal effect on Candida albicans, Staphylococcus aureaus and Escherichia coli.ConclusionExtracts from Jatropha curcas L. have antivirus and bactericidal effects in vitro.
Key words： Jatropha curcas L.； Extracts； Antivirus； Bactericidal
麻瘋樹Jatropha curcas L.，又名黃腫樹、芙蓉樹、假花生、亮桐、嗎哄罕、桐油樹、南洋油桐，屬於大戟科（Euphorbiaceae）麻瘋樹屬Jatropha植物，主要分布於熱帶和亞熱帶地區［1］。麻瘋樹全身皆可入藥，根、莖皮和葉外用具有消腫散淤、止血、殺蟲止癢的功能［2～4］，可用於跌打腫痛、創傷出血、皮膚瘙癢、濕疹等；莖葉內服還可以治療膽結石［2，5］；另經臨床試驗證明［6］，其乳汁具有抗病毒作用。近年來還發現麻瘋樹種子具有顯著的抗癌活性［7］。由此可見，麻瘋樹作為一種新興的資源植物，在新藥開發方麵具有巨大的應用價值。
1 材料
1.1 細胞非洲綠猴腎（Vero）傳代細胞，由中國中醫科學院西苑醫院基礎研究中心病毒室提供。
1.2 雞胚九日齡雞胚，購自中國農業科學院。
1.3 病毒單純皰疹Ⅰ型病毒株（HSV-Ⅰ）、單純皰疹Ⅱ型病毒株（HSV-Ⅱ) 和流感A3型病毒株（A3），由中國預防醫學科學院病毒所提供。HSV-Ⅰ和HSV-Ⅱ經Vero細胞增毒後，分別收集，備用。A3經九日齡雞胚增毒後，其紅細胞凝血效價為1∶160，收集，備用。
1.4 菌種白色念珠菌（Candida albicans，ATCC10231）第5代培養物，金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureaus，ATCC6538）第4代培養物，大腸杆菌（Escherichia coli，ATCC8099）第4代培養物，均由四川省疾病預防控製中心提供。
1.5 藥物麻瘋樹提取物：麻瘋樹幹葉60%乙醇的浸提液，經低壓濃縮並冷凍幹燥後製得黑褐色粉末，編為1號，含生藥10 g/g。以上述浸提液為原料，以大孔樹脂吸附層析法進行梯度洗脫，收集30%和50%乙醇洗脫的產物，經低壓濃縮並冷凍幹燥後製得粉末為黃綠色和棕黃色，對應編為2號和3號，分別含生藥33 g/g和100 g/g。阿昔洛韋滴眼液，1 mg/ml，武漢五景藥業有限公司生產，批號為07010904。病毒唑注射液，100 mg/ml，宜昌三峽製藥廠生產，批號為20070311。
1.6 儀器與試劑96孔細胞培養板；CO2孵箱（日本Yamato 科學株式會社）；倒置顯微鏡（重慶光學儀器廠，型號：1833670）；微孔濾器。DMEM幹粉培養基（美國Invitrogen公司，批號：1290007）、胎牛血清、吐溫。細胞生長液（含10％胎牛血清）、維持液、消化液以及胰酶液（含2％胎牛血清）等按《醫學病毒學基礎及實驗技術》［8］配製。胰蛋白腖大豆瓊脂培養基（TSA）、胰蛋白腖大豆肉湯培養基（TSB）、磷酸鹽緩衝液（PBS）等按《消毒技術規範》［9］配製。
2 方法與結果
2.1 藥物體外抗單純皰疹病毒（HSV）實驗［8］
2.1.1 HSV對Vero細胞的毒力測定將長成單層的Vero細胞用胰酶液消化成單個細胞，以細胞生長液調整細胞數至8.0×104ml。按每孔0.1 ml加入96孔細胞培養板內，放在37℃，5%CO2孵箱中培養24 h。待96孔細胞培養板內的Vero細胞長成單層後，取上述製備好的HSV-Ⅰ和HSV-Ⅱ毒株，用維持液將其分別做10倍係列稀釋(10-1～10-10)，然後按0.1 ml/孔接種於細胞培養板內的Vero單層細胞中，每濃度6個複孔，同時設細胞對照。置37℃，5%CO2孵箱中培養7 d，每日觀察並記錄細胞病變（cytopathic effect，CPE），測定組織細胞半數感染量(TCID50)。結果見表1。表1 單純皰疹病毒的毒力測定（略）
按照Reed-Muench氏法［8］計算，HSV-Ⅰ和HSV-Ⅱ的TCID50分別為10-4.6/ml和10-3.7/ml。在“2.1.3”和“2.1.4”項實驗中，所用病毒液濃度為100 TCID50/0.1ml。
2.1.2 藥物對Vero細胞的毒性實驗用維持液分別將1，2，3號藥物作係列倍比稀釋，藥液濃度梯度為2，1，0.5，0.25，0.125，0.062 5，0.031 25 mg/ml，加入96孔細胞培養板的Vero單層細胞中，0.1 ml/孔，每實驗組4個複孔，同時設細胞對照和阿昔洛韋對照（陽性對照）。置37℃，5%CO2孵箱中培養，觀察CPE，並記錄各藥物的最大無毒濃度（TC0），共7 d。最後，按照Reed-Muench氏法［8］計算出各藥物的半數有毒濃度（TC50）。
經觀察，各藥物對細胞的毒性都較小。計算得知麻瘋樹1，2，3號提取物的TC0和TC50依次為： 0.25 mg/ml和0.56 mg/ml；0.25 mg/ml和0.53 mg/ml；0.125 mg/ml和0.14 mg/ml。
2.1.3 藥物對HSV在細胞內增殖的抑製作用將100 TCID50/0.1 ml的HSV-Ⅰ接種於96孔細胞培養板的Vero單層細胞中，0.1 ml/孔，置37℃孵箱內吸附1 h。同時，以TC0為各藥的起始濃度，將1，2，3號藥物作係列倍比稀釋，備用。待病毒吸附後，取出孵箱內的細胞培養板，倒掉其中液體，用維持液洗兩次，再分別加入預先稀釋的各藥液，0.1 ml/孔，每個實驗組4個複孔，同時設細胞對照、病毒對照以及阿昔洛韋對照。置37℃、5%CO2孵箱中培養，每日觀察CPE，當病毒對照組的CPE達“++++”時，（注：“－”表示無細胞病變； “+”表示有25%細胞病變；“++”表示有50%細胞病變；“+++”表示有75%細胞病變；“++++”表示有100%細胞病變。）終止實驗。按照上述方法，以HSV-Ⅱ進行相同實驗操作。結果見表2。並根據Reed - Muench 氏法［8］計算出1，2，3號藥物對不同病毒的EC50 (半數有效濃度) ，以治療指數(TI，therapeutic index)來評價藥物抑製病毒在細胞內增殖的作用，記為TI1，TI1= TC50/ EC50。結果見表3。表3 麻瘋樹提取物抑製單純皰疹病毒增殖的治療指數（略）
由表2可見，1，2，3號藥物均能抑製HSV在細胞內的增殖。其中1號和2號藥物在0.25 mg/ml時能夠100%抑製病毒的增殖，而3號藥物在0.062 5 mg/ml即可達到完全抑製病毒增殖的作用。由表3可見，藥物對HSV-Ⅰ的治療指數以3號最高，達7.00，1號最低，僅為3.11。此外，1號和3號藥物對HSV-Ⅱ的治療指數相同，均為3.50，略高於2號藥物的3.31。總體而言，2號和3號藥物對HSV-Ⅰ在細胞內增殖的抑製作用強於對HSV-Ⅱ的抑製作用。表2 麻瘋樹提取物對單純皰疹病毒在細胞內增殖的抑製作用（略）
2.1.4 藥物對HSV的直接滅活作用將預先稀釋的1，2，3號藥物液（稀釋方法同“2.1.3”項）與100 TCID50/0.1 ml的HSV-Ⅰ病毒液等量混合，置37℃溫箱內1 h。然後接種於96孔細胞培養板的單層Vero細胞中，0.2 ml/孔，每個實驗組4個複孔，同時設細胞對照、病毒對照以及阿昔洛韋對照。再放入37℃孵箱吸附1h。取出，倒掉其中液體，用維持液洗兩次後，將維持液按0.1ml/孔加到細胞培養板內，置37℃，5% CO2孵箱中培養，每日觀察記錄CPE，當病毒對照組的CPE達“++++”時，終止實驗。按照上述方法，以HSV-Ⅱ進行相同實驗操作。結果見表4。計算出1，2，3號藥物對病毒的半數有效濃度，記為EC50。同樣以治療指數來評價藥物對病毒的直接殺傷作用，記為TI2，TI2 = TC50/ EC50。結果見表5。表5 麻瘋樹提取物直接滅活單純皰疹病毒的治療指數（略）
由表4可見，所有藥物都能將HSV直接滅活。1號和2號藥物在濃度為0.062 5 mg/ml時能滅活所有HSV-Ⅰ，在0.25 mg/ml時能滅活全部HSV-Ⅱ。而3號藥物在0.015 6 mg/ml時能滅活HSV-Ⅰ達100%，濃度達到0.062 5 mg/ml時能完全滅活HSV-Ⅱ。由表5可見，所有藥物對HSV-Ⅰ直接滅活的治療指數顯著高於HSV-Ⅱ。在對HSV-Ⅰ的直接滅活中，1號和3號藥物的治療指數較高，為14.00，2號藥物的指數略低，為13.25。表4 麻瘋樹提取物對單純皰疹病毒的直接滅活作用（略）
2.2 藥物體外抗流感A3型病毒（A3）實驗［8］
2.2.1 A3對雞胚的毒力測定取上述製備好的A3，用生理鹽水作10倍係列稀釋(10-1～10-10)，然後將不同濃度的病毒接種於九日齡雞胚中，0.1 ml/胚，每濃度4個複胚，同時設空白對照。以蠟封住注射孔，放33℃溫箱中培養48 h，然後置於4℃冰箱中過夜，次日取出，取尿囊液，用0.5%雞紅細胞作血凝試驗，並計算病毒血凝滴度。
經計算，病毒致雞胚半數感染量（EID50）為10-4/ml。在“2.2.3”和“2.2.4”項實驗中，所配A3濃度為50EID50/0.1 ml。
2.2.2 藥物對雞胚的毒性測定用生理鹽水將1，2，3號藥物作係列倍比稀釋，藥液濃度梯度為40，20，10，5和2.5 mg/ml。將不同濃度的藥物注入九日齡雞胚中，0.1 ml/胚，每實驗組4個重複，同時設空白對照和病毒唑對照（陽性對照）。以蠟封住注射孔，放33℃溫箱中培養48 h後，取出，敲碎蛋殼，觀察記錄雞胚的存活情況。
經過觀察，1，2，3號藥物對雞胚的TC0均為20 mg/ml，計算得出它們的TC50依次為28.17，28.57和50 mg/ml。
2.2.3 藥物對A3在雞胚內增殖的抑製作用將50EID50/0.1ml的A3接種於九日齡雞胚中，0.1 ml/胚，放33℃吸附1 h。同時，以20 mg/ml為各藥物的起始濃度，用生理鹽水將1，2，3號藥物作係列倍比稀釋，濃度梯度為20，10，5，2.5，1.25和0.625 mg/ml，備用。待病毒吸附時間一到，將稀釋好的藥物注入雞胚內，0.1 ml/胚，每實驗組4個重複，同時設空白對照、病毒對照和病毒唑對照。以蠟封住注射孔，放33℃溫箱中培養48 h，然後置於4℃冰箱中過夜，次日取出，取雞胚尿囊液，用0.5%雞紅細胞測血凝。結果見表6。計算出1，2，3號藥物的EC50 (半數有效濃度) ，並以治療指數(TI)來評價藥物對病毒在細胞內增殖的抑製作用，記為TI3，TI3 = TC50/ EC50。結果見表7。表7 麻瘋樹提取物對流感A3型病毒的治療指數（略）
由表6可見，1號和2號藥物均不能抑製A3在雞胚內的增殖，隻有3號藥物在20 mg/ml時可完全抑製A3的增殖。如表7所示，3號藥物對流感A3型病毒的治療指數為5.66。表6 麻瘋樹提取物對流感A3型病毒在雞胚內增殖的抑製作用（略）
2.2.4 藥物對A3的直接滅活作用將稀釋好的1，2，3號藥物（稀釋方法同“2.2.3”項）與50EID50/0.1 ml的A3等量混合，置33℃溫箱中和1 h。然後接種於九日齡雞胚中，0.2 ml/胚，每實驗組4個重複，同時設空白對照、病毒對照和病毒唑對照。以蠟封住注射孔，放33℃溫箱培養48 h，然後置於4℃冰箱中過夜，次日取出，取雞胚尿囊液，用0.5%雞紅細胞測血凝效價。結果見表8。計算出1，2，3號藥物的EC50 (半數有效濃度) ，以治療指數(TI)來評價藥物對病毒的直接滅活作用，記為TI4，TI4= TC50/ EC50。結果見表9。表9 麻瘋樹提取物對流感A3型病毒的中和指數（略）
由表8可見，1號藥物在0.5 mg/ml時能滅活所有A3，2號藥物在1 mg/ml時才能將全部病毒滅活，而3號藥物在0.125 mg/ml時即可100%滅活病毒。因此，如表9所示，3號藥物直接滅活A3的治療指數高達1 250.00，1號藥物次之，為78.25，而2號藥物的治療指數最低，為69.68。表8 麻瘋樹提取物對流感A3型病毒的直接滅活作用（略）
2.3 藥物體外殺菌實驗［10］
2.3.1 菌懸液的配製刮取白色念珠菌的平板培養物, 以胰蛋白腖生理鹽水溶液（TPS）稀釋成菌懸液。搖勻後，采用活菌培養計數，然後以TPS液稀釋至實驗所需濃度，1×108～5×108 cfu/ml。按照同樣的方法，製備金黃色葡萄球菌和大腸杆菌的菌懸液。
2.3.2 藥液的配製取適量1號藥物，以無菌蒸餾水配製成濃度為150 mg/ml的溶液。2.3.3 麻瘋樹根提取物1號的殺菌實驗以蒸餾水配製3%的牛血清白蛋白溶液作為有機幹擾物質。取一支無菌大試管，先加入0.5 ml白色念珠菌懸液，再加入0.5 ml有機幹擾物質，混勻，置 20℃水浴5 min後，用無菌吸管吸取預先配製的藥液4.0 ml 注入其中，迅速混勻並立即記時。以同樣的方法，對金黃色葡萄球菌和大腸杆菌進行實驗操作。
以含0.5％卵磷脂＋2％吐溫－80的0.03 mol/L的磷酸鹽緩衝溶液（PBS，0.03 mol/L，pH7.2）為中和劑。待實驗細菌與藥液相互作用1 min後，分別吸取0.5 ml實驗菌懸液與藥液的混合液加於 4.5 ml 經滅菌的中和劑中，混勻。10 min 後，分別吸取1.0 ml樣液，按活菌培養計數法測定存活菌數。重複上述操作，但將實驗細菌與藥液相互作用時間延長至2 min和3 min，最後再進行活菌計數。同時用TPS液代替藥液，進行平行試驗，作為陽性對照，其活菌培養計數結果代表菌懸液原有濃度，將其作為計算殺滅對數的初始濃度。所有實驗組均在37℃溫箱中培養，48 h後觀察結果。
實驗重複3次，計算各組的活菌濃度（cfu/ml），並換算為對數值（N），然後按下式計算殺滅對數值:
殺滅對數值 (KL)＝對照組平均活菌濃度的對數值（No）－試驗組活菌濃度對數值（Nx）
由表10可見，1號藥物對白色念珠菌作用1 min則可達到100%的平均殺滅率，對金黃色葡萄球菌作用1 min後其平均殺滅率為99.77%，繼續作用至3 min末則可達到99.77%的平均殺滅率，而對大腸杆菌作用1 min即達到99.98%的平均殺滅率，繼續作用至2 min末其殺滅率提高至99.99%，作用時間持續到3 min末其殺滅率仍為99.99%，不再變化。表10 麻瘋樹提取物1號的殺菌效果（略）
3 討論
單純皰疹病毒是人體重要致病病毒，能引起口唇皰疹、生殖器皰疹、腦炎及內髒器官的感染。流感病毒所引發的流行性感冒是一種急性呼吸道疾病，具有發病快、傳染性強、發病率高的特點，臨床症狀多為高熱、寒戰、頭痛、全身關節痛等。這兩類病毒都嚴重威脅著人類健康，但至今仍缺乏針對它們的有效抗病毒藥物。本研究旨在從植物資源中提取出安全而有效的抗病毒活性成分，從而為上述疾病的臨床治療提供更多更好的選擇。
以上研究表明，麻瘋樹提取物能有效抑製單純皰疹病毒的增殖，效果雖不比阿昔洛韋，但對該病毒直接滅活作用效果卻明顯優於阿昔洛韋。麻瘋樹提取物還對流感病毒具有顯著的直接滅活作用。此外，該提取物還具有強效殺菌作用。綜上所述，麻瘋樹提取物在抗病毒藥物以及外用殺菌噴劑的開發方麵具有良好的應用前景。
作者：劉娟 雷蕾 唐琳 李昱星 陳放 《時珍國醫國藥》
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