中藥提取物對龍膽葉枯病病原菌抗菌活性的篩選

【摘要】  　　目的篩選抗龍膽葉枯病菌活性的中藥。方法以龍膽葉枯病菌（Alternaria sp.）為供試菌種，對9種中藥乙醇提取物進行抗龍膽葉枯病菌活性實驗，采用有限稀釋法，測定最低抑菌濃度。結果9種中藥乙醇提取物均有抑菌作用，其中蛇床子、川楝子提取物14 d的最低抑菌濃度MIC100小於0.1 g/ml。結論蛇床子、川楝子具有較強的抗龍膽葉枯病菌作用，可進一步開發為防治龍膽葉枯病藥物。

【關鍵詞】  中藥殺菌劑 抑菌作用 活性篩選 龍膽葉枯病

　　Abstract:Objective  To screen the antifungal activity against Alternaria sp. of TCMs. MethodsThe antifungal activity against Alternaria sp. for the ethanol extracts of nine speices of TCMs was tested on Alternaria sp. Use limiting dilution to test the minimum inhibitory concentration.ResultsAll the ethanol extracts of TCMs exhibited inhibition on Alternaria sp.. The minimum inhibitory concentration of Fructus Cnidii, Fructus Tossendan was under 0.1 g/ml. Conclusion The antifungal activity of Fructus Cnidii, Fructus Toosendan against Alternaria sp.. is much stronger and can be developed.

　　Key words:Fungicides of TCMs；  Inhibition；  Screening；  Rough gentian

　　龍膽葉枯病（Alternaria sp.）是龍膽生產中的重要葉部病害，發生普遍。在龍膽及其它藥材生產中對病害的防治大量使用化學藥劑，導致環境汙染、農藥殘留，影響藥材的質量。我國中藥資源豐富，許多中藥含抑菌活性物質［1～3］，從中尋找抑製植物病原菌活性物質，研製植物源新型殺菌劑，防治藥用植物病害，對生產符合GAP標準中藥材具有重要意義。

　　目前，國內外學者在中草藥抗真菌實驗方麵已做了大量的工作 ［1～5］，而從中篩選抗藥用植物病原真菌的研究較少。本研究根據以往中藥抗真菌文獻報道，選出9種中藥，研究其對龍膽葉枯病菌（Alternaria sp.）的抑製作用。

　　1  材料與方法

　　1.1   材料

　　1.1.1  中藥 

　　地膚子、苦參 、知母、川楝子、蛇床子、大風子、蒼耳子、白鮮皮、土槿皮購於哈爾濱市同泰大藥房，經鑒定為正品； 95%乙醇（天津泰達化工有限公司），葡萄糖（沈陽市試劑三廠），瓊脂（青島水產品加工廠）。

　　1.1.2   供試菌種

　　龍膽葉枯病菌,從黑龍江北安栽培的粗糙龍膽Gentiana scabra Bunge中分離純化得到，采用從病組織分離培養，將分離得到的菌種接種到PDA培養基上培養［6］，待產生孢子後，采用單孢分離的方法對菌種進行純化。應用柯赫氏證病法則（Kochˊs postulate）證明為龍膽葉枯病病菌，通過對分生孢子梗、分生孢子等的觀察鑒定為Alternaria sp.。

　　1.1.3  培養基 

　　用PDA培養基。

　　1.2  方法

　　1.2.1  樣品的製備

　　將中藥樣品於60℃烘幹，經粉碎過20目篩，加5倍量的95%乙醇回流提取兩次，2 h/次，濾過，濾液減壓濃縮至1 g/ml（即每毫升含1 g生藥）。濃縮液於冰箱（0～4℃）冷藏備用。

　　1.2.2  菌種活化

　　將保存的菌種接於PDA培養基上培養4d備用。

　1.2.3  抑菌實驗  

　　在無菌操作條件下，以1 g/ml生藥的藥液為原液，用滅菌PDA培養基稀釋，分別 稀釋為原液的50% ，40% ，30% ，20%，10% ，5%，1% ，0.8%，0.6%，0.4%，0.2%，0.1%（相當於每毫升含0.5，0.4，0.3，0.2，0.1，0.05，0.01，0.008，0.006，0.004，0.002，0.001 g生藥）12個濃度的藥基，對照為70%乙醇代替藥液配製，並控製藥基中的乙醇含量在15%以下（在配製高濃度的藥基前，對加入的藥液揮去部分乙醇），每管接種新培養的真菌菌落邊緣2 mm2的真菌菌絲塊，重複3次，25℃培養。每天觀察接種菌落生長情況，凡生長的菌落記為“+”，凡完全不生長的菌落記為“-”。

　　1.2.4   MIC100的確定 

　　MIC100為殺真菌劑(fungicide)的最低抑菌濃度，菌種接種在每種藥物係列梯度濃度培養基上，恒溫箱中培養7 d 和14 d，用肉眼觀察，接種菌塊未擴大，無細胞生長，取完全不生長管最低藥物濃度為最低抑菌濃度(MIC)。

　　2  結果

　　抗菌實驗結果見表1。表1  9種中藥乙醇提取物對龍膽葉枯病菌（Alternaria sp.）的抑製作用（略）

　　由表1給出各中藥乙醇提取物的最低抑菌濃度，結果見表2。表2  中藥乙醇提取物對龍膽葉枯病菌（略）

　　結果表明，9種中藥乙醇提取物對龍膽葉枯病病菌（Alternaria sp.）均有不同程度的抑製作用，隨著培養時間的延長，抑菌作用逐漸減弱，培養7 d最低抑菌濃度MIC100≤0.2 g/ml有地膚子、蛇床子、白鮮皮、川楝子、大風子，最低抑菌濃度MIC100≤0.1 g/ml有蛇床子、白鮮皮、川楝子；培養14 d最低抑菌濃度≤0.2 g/ml有川楝子、蛇床子、大風子，培養14 d 最低抑菌濃度MIC100為0.1 g/ml有川楝子、蛇床子。將藥基上的菌種轉接到無藥PDA培養基上仍不能生長，表明真菌已被殺死，川楝子、蛇床子乙醇提取物有較強抗龍膽葉枯病菌（Alternaria sp.）作用，其次為白鮮皮和大風子，可進一步作田間實驗。

　　3  討論

　　用乙醇提取抗菌活性物質優於水提法［4，7］。本實驗采用乙醇回流提取法，有利於生物堿等生物活性物質的提取，同時減少了提取液中蛋白質、多糖等雜質。

　　本實驗采用在藥基上接種菌絲體的方法測定藥物抗真菌活性，屬於固體瓊脂篩選抗真菌藥物，並采用有限稀釋法測定MIC100，該法操作簡便。前人實驗多采用培養基與藥物同時滅菌的方法，本實驗在藥基配製時，僅對培養基進行高溫滅菌，冷卻至70℃左右用微量移液器加入藥物，藥物有效成分不被破壞，在經長時間培養未滋生雜菌，實驗方法可靠。

　　由真菌引起的病害防治困難，隻要有部分真菌細胞不被殺死，在適宜條件下就能生長繁殖，因此本抗菌實驗以真菌生長完全受到抑製來評價抑菌效果,即在較長時間(14 d)仍能保持對真菌生長的抑製，才是理想的抗菌藥物。9種中藥經長時間抑菌試驗觀察，川楝子、蛇床子乙醇提取物對龍膽葉枯病菌抑菌作用強而持久，是理想的抗龍膽葉枯病真菌的中藥。白鮮皮在培養7 d時抑菌作用最強，雖然到14 d時抑菌作用有所下降，也是一個較理想的抗真菌藥物。有待對其抗菌機理進一步研究。

作者：孫海峰 王喜軍 王蘇豔 楊婷《》

  　　［1］曹仁烈，孫在原.中藥水浸劑在試管內抗皮膚真菌的觀察［J］.中華皮膚科雜誌,1957,4：286.

　　［2］王理達，胡迎慶，屠鵬飛，等.13種生藥提取物及化學成分的抗真菌活性篩選［J］.中草藥,2001,32(3):241.

　　［3］馮俊濤,石勇強,張　興.56種植物抑菌活性篩選試驗［J］.西北農林科技大學學報(自然科學版),2001,29(2):65.

　　［4］馬廉蘭,鍾有添.6種中草藥對深部感染真菌的體外抑菌效果［J］. 贛南醫學院學報, 2001,21(1):1.

　　［5］方中達. 植病研究方法［M］.北京：農業出版社,1987：83，150.

　　［6］高微微，李 展，林文衛.中藥提取物的抑菌試驗［J］.中國飼料,1999,12：12.

　　［7］徐叔雲，卞如濂，陳 修.藥理實驗方法學［M］.北京：人民衛生出版社，2002：1711.