【摘要】 幽門螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)是消化道的主要致病因素之一,與多種胃部疾病密切相關,並被認為是胃炎和胃潰瘍產生的病原學因素。空泡毒素(Vacuolating cytotoxin, VacA)被認為是Hp的主要毒力因子,在體外可引起真核細胞形成空泡,因此，VacA的研究成為近年來研究Hp致病機製的新熱點,本文對VacA的基因結構、生物學活性、作用機製等方麵的研究作一綜述。
【關鍵詞】 VacA；幽門螺杆菌
幽門螺杆菌（Hp）是1983年由Marshall和Warren首次分離得到的一種革蘭染色陰性的、螺旋狀、微需氧、主要定居在人胃黏膜、引起人類消化道疾病發生發展的重要病原菌。幽門螺杆菌的感染呈全球性分布，其感染率與當地公共衛生狀況有關，據報道，在西方國家大約30%～50%的成人感染Hp；在中國，其感染率更高，達50%～80%，並有報道指出人群中感染Hp的比例隨年齡增長而提高，而且Hp一旦在人胃內定居，如不采取抗菌治療，可以持續幾十年,嚴重危害著人群健康。盡管大多數Hp感染者無症狀，但有近似10％的感染者患上了胃十二指腸潰瘍，胃癌或黏膜相關組織（MALT）淋巴瘤。1994年Hp被WHO定為第I類致癌因子，而其分泌的蛋白毒素VacA作為單一毒力因子可引起靶細胞空泡化、細胞凋亡、細胞骨架重排，最終導致細胞死亡，因此是Hp重要的毒力因子。僅僅發現於1983年的Hp現在是研究得最深入的病原體之一,現就近幾年來研究較多的Hp毒力因子VacA綜述如下。
1 VacA蛋白基因結構和基因型
1.1 VacA的基因結構 T.L.Cover於1993年克隆出了VacA的基因，發現其由3864個堿基對組成，編碼1287個氨基酸，編碼的蛋白質分子量為139kDa，此為VacA的前體分子，包括三個區域：（1）N-末端為33個氨基酸殘基組成的前導信號序列；（2）中間區域為成熟的空泡毒素；（3）C-末端為50kDa的多肽，其氨基酸順序與許多G＋細菌的外膜蛋白有同源性。在去掉N末端的信號肽，C末端的類似於IgA蛋白酶前體的肽鏈等修飾後，成為成熟的87kDa的VacA。該活性毒素可降解為37kDa及58kDa兩個亞單位。
VacA可能是具有A-B結構的細菌毒素家族，B亞單位與靶細胞表麵的膜受體結合並介導A亞單位進入胞漿，A亞單位與細胞內靶分子特異性共價結合後，導致細胞重要功能的破壞，從而發揮毒素活性［1］。
從液體培養上清中提純的VacA是一個分子量大於900kDa的寡聚複合物，完整的VacA分子呈花瓣狀或雪花狀，由6～7個沿半徑對稱的95kDa的VacA單體組成［2］。VacA暴露於酸性pH下可使得寡聚複合物解聚為單體並與VacA細胞毒性的增強有關。
1.2 VacA的基因型 根據VacA5，末端序列的不同，可分為2個不同的類型：s1(包括s1a,s1b2個亞型)，s2；根據中間序列的不同又可分為2個類型：m1和m2。這些等位基因理論上產生的重組體除s2/m1外（推測s2/m1型可能是致死性的），經證實都存在。因此，根據VacA序列的不同可將Hp分為s1/m1、s1/m2、 s2/m2。美國的Hp菌株以s1/m1亞型為主，而中國的則以s1/m2亞型占優勢［3］。
2 VacA的生物學活性
2.1 VacA的空泡化作用 VacA誘導細胞空泡形成，這些空泡的膜包含晚期胞內體和晚期溶酶體的標誌物［4］。空泡的形成和維持所需的一些細胞內的酶已被證實，這包括空泡ATP酶［5］和小GTP結合蛋白Rab7［6］Rac1［7］。其中空泡ATP酶能夠調整通過細胞內間隔膜上的氫離子的流量，因此對於空泡ATP酶的需要提示空泡前體腔內的pH必須是酸性的以便VacA誘導細胞空泡形成。Rab7是調節膜上的離子通道與促進溶酶體融合的GTP酶,位於晚期內體膜上,並且是晚期內體的標誌物。支持膜沉積及晚期內體之間的同型融合。而Rac1則控製影響膜運輸的細胞骨架成分。即使在檢測不到空泡化的情形下，VacA也能改變晚期吞噬途徑和溶酶體的功能。有研究顯示VacA的空泡化作用受Hp尿素酶的影響，因尿素酶能分解尿素產氨，而氨能促進VacA的空泡化作用。
2.2 VacA幹擾組織細胞損傷修複機製 VacA能特異地抑製細胞增殖，延緩潰瘍的愈合。最近研究表明VacA參與表皮生長因子（EGF）激活的信號轉導通路，Fujiwara等［8］在研究Hp毒素及EGF對胃癌KatoⅢ細胞共同作用的過程中發現，不影響細胞活力的VacA毒素劑量可顯著抑製EGF與表皮生長因子受體（EGFr）的結合，並減少EGF刺激引起的細胞增殖達22%。Pai等［9］用EGF作用於胃癌KATOⅢ細胞後，可以增強EGFr的表達及其自身磷酸化，VacA可以抑製上述過程。由上可知,VacA幹擾了EGF介導的信號轉導通路。可能是VacA與RPTPβ的結合促進EGF受體蛋白酪氨酸的去磷酸化，導致EGF作用減弱，因而幹擾上皮修複並延遲潰瘍愈合。
2.3 VacA對機體免疫的影響 Molinari等［10］研究了VacA對抗原處理細胞前溶酶體內抗原呈遞過程的影響，結果表明，VacA可以特異性的抑製由MHC-Ⅱ類抗原介導的抗原呈遞過程，表明VacA可幹擾機體保護性免疫而有利於Hp在胃內持續感染，引起相應的臨床症狀。
2.4 VacA對於細胞功能的其他作用
2.4.1 引起細胞凋亡 VacA能引起線粒體去極化並部分損耗細胞內的ATP，但這在體外試驗中對細胞不是致死的［11］。人類的胃細胞對VacA非常敏感，VacA進入線粒體伴隨著凋亡，這與線粒體釋放細胞色素C和caspase3活化有關，細胞中毒2天後就有細胞死亡。體內的細胞毒實驗結果證明還有其他的刺激因素存在，cag＋和表達VacA的Hp株在體內和體外所激發的胃上皮細胞的凋亡率更高［12］。
2.4.2 引起細胞骨架重排 VacA能影響或與細胞骨架的多種成分相互作用引起肌動蛋白重排、Rac-1的改變，而且還能使微管網絡解體。這些現象與VacA誘導的細胞增生有關。
2.4.3 其他作用 VacA還能使第二信使產生增加,刺激AGS細胞分泌胃蛋白酶原，增強Hp的侵襲力。不過這些發現還有待於進一步研究。
3 VacA的作用機製
3.1 VacA結合細胞受體 VacA結合到真核細胞表麵是細胞中毒的第一步。3種細胞表麵蛋白被認為是VacA的受體：（1）AGS細胞表麵的140kDa蛋白；（2）HeLa細胞的EGF受體；（3）RPTPβ。在這3種假定的受體當中，VacA與RPTPβ的相互作用已被證實。
s1/m1型VacA能引起許多不同細胞的空泡化，因此認為其能有效的結合這些細胞係。相反，s1/m2型VacA也能引起一些細胞係的細胞產生空泡而對另一些則作用甚微。這表明s1/m1型VacA和s1/m2型VacA結合的細胞類型不同，因為它們之間的主要區別在於p58的C－末端，提示毒素結合細胞所需的氨基酸序列位於p58內［13］。p58的抗體能抑製VacA結合HeLa細胞，而且GST-p58融合蛋白能結合HeLa細胞。
3.2 VacA－膜相互作用 研究表明［14］活化的VacA能插入脂質體膜而未活化的VacA卻不能，此相互作用引起離子和熒光分子的釋放。低pH活化VacA引起疏水端暴露的增加，因為低pH活化與可溶的VacA寡聚體解離為單體有關，以前隱藏的疏水端的暴露可能涉及到膜的插入。屬於VacAp37的三個區域在膜插入後變得能抵禦蛋白酶的消化，這提示此三個區域不是插入脂質雙層就是轉位到脂質體膜腔，大部分p58留在膜外。
3.3 VacA的內化 VacA結合到細胞表麵之後慢慢的內化。p58介導的表麵受體的結合對於接下來中毒的步驟來說是遠遠不夠的。事實上，一個僅含p58的缺失變異的VacA能結合細胞但不能內吞［15］。因此，在毒素內化過程中可能存在其他的相互作用，或是由p37N－末端介導的，或是依賴於VacA的寡聚化［16］。內化是細胞空泡化的必要步驟。
3.4 VacA在細胞內的活性 VacA內化後提示其能在內化位點發揮毒性作用。為測試這個假設，HeLa細胞被轉染了編碼VacA的質粒，當其在胞質中表達時，VacA誘導的空泡形成與外加的VacA誘導的空泡性質一樣［17］。免疫熒光分析顯示細胞內表達的VacA以一種可溶的形式存在於胞質和正在空泡化的腔室中。Galmiche等［18］報道表達在HEp－2細胞質的全長VacA和p34能遷移到線粒體基質，而p58卻保留在胞質中，這些證據表明VacA進入細胞質後能進一步轉位通過線粒體膜。
3.5 離子通道的形成 實驗顯示插入脂質雙層的酸活化的VacA能引起通道形成，而此通道是具離子選擇性的。大多數學者認為通道的形成在VacA誘導典型的空泡形成中起了直接的作用,可能原因是內化的毒素在晚期胞內體間隔上形成陰離子選擇性的通道,對陰離子滲透性的增加會增加空泡型ATP酶的作用,從而導致CL與具有滲透性的胺鹽在胞內體腔中積聚,進而導致胞內體的腫脹與融合,最後形成空泡。抑製實驗顯示阻礙VacA通道形成的複合物同樣抑製了空泡的形成，而且有效性相同，這充分說明了VacA的孔形成活性是其細胞毒性所必需的。Szabo等［19］進一步證實了VacA能增強Hela細胞膜上的離子選擇性通道,並使其去極化。VacA的氨基末端親水區能促進毒素的插入，因此缺失了氨基末端的VacA既不能誘導空泡形成也不能形成通道，蛋白分析也顯示p34對於通道的形成起重要作用。
4 VacA的臨床意義
4.1 VacA的臨床相關性 1989年Figura［20］等比較了從77例胃潰瘍病人和胃炎病人中分離出的Hp菌株的細胞毒素的產生。他們發現從胃潰瘍病人當中分離出的菌株66.6％能產生細胞毒素，而從胃炎病人中分離出的隻有30.1%,這種顯著的差異表明細胞毒素可能與胃潰瘍的產生密切相關。此外，Atherton［21］等發現了vacAs1基因型與胃潰瘍的重要相關性。vacAs1基因型與胃癌也具同樣的相關性。
4.2 VacA作為未來疫苗的前景 Hp能定居在小鼠的胃內，Ⅰ型菌株的感染可引起與人類疾病相似的胃部病變，使用純化的VacA和E.coil不耐熱腸毒素作為佐劑免疫這種小鼠模型可保護其免遭Ⅰ型菌株的感染。說明VacA有免疫原性，可作為預防Hp感染的疫苗。
從Hp培養上清液中高度純化的VacA有生物學活性，免疫家兔後可誘導家兔產生中和抗體。其血清研究顯示其包含大部分能夠識別構象表位的抗體。說明空泡毒素在體內有構象變化,因此針對VacA的免疫應答的建立依賴於VacA天然的構造，針對重組VacA的抗血清不能中和空泡活性，而且也不能識別天然的VacA，那麽對於這種空泡毒素的疫苗隻有使用完整的分子才可能有效。但是由於聚集的問題，尚未合成有活性的VacA，但是天然的VacA能通過甲醛脫毒，甲酰化的VacA仍然能夠結合靶細胞，但沒有空泡活性，盡管其誘導產生的中和抗體與天然未經處理的VacA誘導產生的相比有一些改變但仍被成功地應用於保護實驗當中。
對於Hp疫苗的各項研究預示，隨著對VacA構象（單體分子的聚集）問題的解決，VacA很有可能成為預防和治療Hp感染的有效疫苗。
作者：鄭筱雯（綜述），李玉虎（審校）
作者單位：1 330006 江西南昌,南昌大學醫學院研究生部
【參考文獻】
1 Lupetti P.Oligomeric and subunit structure of the Helicobacter pylori vaculating cytotoxin.J Cell Biol,1996，133:801-807.
2 Lanzavecchia S.Three-dimensional reconstruction of metal replicas of the Helicobacter pylori vaculating cytotoxin.J Struct Biol,1998，121(1):9-18.
3 Atherton J C.Mosaicism in vaculating cytotoxin alleles of Helicobacter pylori.J Biol Chem,1995，270(30):17771-17777.
4 Papini E.Celluar vacuoles induced by Helicobacter pylori originate from late endosomal compartments.Proc Natl Acad Sci USA,1994，91:9720-9724.
5 Cover T L.Effects of ATPase inhibitors on the response of HeLa cells to Helicobacter pylori vaculating cytotoxin.Infect Immun,1993，61:1427-1431.
6 Papini E.The small GTP binding protein rab7 is essential for cellular vacuolation induced by Helicobacter pylori cytotoxin.EMBO J,1997，16:15-24.
7 Hotchin N A.Cell vacuolation induced by VacA cytotoxin of Helicobacter pylori is regulated by the Rac1 GTPase.J Biol Chem,2000，275:14009-14012.
8 Fujiwara Y.Gastroenterology,1995，108(4):A79.
9 Pai R,Wyle FA,Cover TL,et al. Helicobacter pylori culture supernatant interferes with epidermal growth factor-activited signal transduction in human gastric cells.Microb Pathog,1999，26(1):45-52.
10 Molinari M,Salio M,Galli G,et al.Selective inhibition of T-dependent antigen presentation by Helicobacter pylori toxin VacA.J EXP Med,1998，187(1):135-140.
11 Kimura M.Vaculating cytotoxin purified from Helicobacter pylori causes mitochondrial damage in human gastric cells.Microb Pathol,1999，26:45-52.
12 Rudi J.Invlvement of the CD95(APO-1/Fas)receptor and ligand system in Helicobacter pylori gastric epithelial apoptosis.Clin Invest,1998，102:1506-1514.
13 Pagliaccia C.The m2 form of the Helicobacter pylori cytotoxin has cell type-specific vacuolating activity.Proc Natl Acad Sci USA,1998，95:10212-10217.
14 Moll G.Lipid interaction of the 37-kDa and 58- kDa fragments of the Helicobacter pylori cytotoxin.Eur J Biochem,1995，234:947-952.
15 Reyrat J M.3D imaging of the 58kDa cell binding subunit of the Helicobacter pylori cytotoxin.J Mol Biol,1999，290:459-470.
16 Garner J A.Binding and internaization of the Helicobacter pylori vacuolating cytotoxin by epithelial cells.Infect Immun,1996，64:4197-4203.
17 de Bernard M.Helicobacter pylori toxin VacA induces vacuole formation by acting in the cell cytosol.Mol Microbiol,1997，26:665-674.
18 Galmiche A.The N-terminal 34 kDa fragment of Helicobacter pylori vacuolating cytotoxin targets mitochondria and induces cytochrome c release.EMBO J,2000，19:6361-6370.
19 Szabo I,Brutsche S,Tombola F,et al. Formation of anion-selective channels in the cell plasma membrane by the toxin VacA of Helicobacter pylori is required for its biological activity. EMBO J, 1999, 18(20):5517-5527.
20 Figura N,Guglielmetti P.Cytotoxin production by Campylobacter pylori strains isolated from patients with peptic ulcers and from patients with chronic gastritis only.J Clin Microbiol,1989，27:225-226.
21 Atherton JC,Cao P.Mosaicism in vacuolating cytotoxin alleles of Helicobacter pylori.J Biol Chem,1995，270：17771-17777.
上一篇：痰細菌學培養的臨床應用
下一篇：一種新型腸杆菌科試驗卡的實驗室應用評價
