抗真菌藥敏試驗濃度梯度法與NCCLS方案的比較研究

真菌感染、尤其是免疫低下患者機會性真菌感染發病率的不斷上升使真菌病的治療麵臨著嚴峻的挑戰。雖然有一些抗真菌藥物相繼問世,給真菌病治療帶來了新的轉機,但同時有關藥物治療耐藥的報道也逐漸增多。由於體外藥敏試驗的主要目的是幫助預測臨床抗菌治療的療效,如何對抗真菌藥物體外敏感性進行恰當的評價已成為一個突出而亟待解決的問題。目前,已經得到批準的美國國家臨床實驗室標準化委員會(NCCLS)M-27A方案[1],經全世界各地多個實驗室廣泛應用,在采用液體培養基稀釋法(包括試管法和微量法)對酵母菌進行抗真菌藥物體外敏感試驗方案上得到了很好的一致性和穩定性結果。但有關藥敏試驗與臨床療效的一致性還有待進一步研究。從方法學上,也需要一種臨床實驗室中更為簡便、實用的替代方法。濃度梯度(Etest)法正是近年來在NCCLS方法基礎上開發出的一種比較簡便、省時、省力的抗真菌藥敏試驗新方法。自1993年以來,許多學者圍繞Etest與NCCLS方案結果的一致性、重複性、識別耐藥菌株的作用及與臨床療效的關係方麵進行了一係列比較研究,其目的是希望尋找一種結果與NCCLS方案一致,操作過程較之更為簡便、快速、直觀,更易發現耐藥菌株並且與臨床療效更為一致的方法,現將近年來國外對這兩種試驗方法的比較研究做一綜述。

 

一、NCCLS M-27方案與Etest方法

NCCLS M-27方案,即"酵母菌液體培養基稀釋法抗真菌藥物敏感試驗方案",是用液體培養基配製一係列稀釋度的藥液,然後接種受試菌株的菌懸液,經一定溫度孵青後,測定藥物在體外抑製真菌生長的最低藥物濃度,此方法準確性佳、重複性好,實驗室間結果的一致性可以與抗細菌的藥物敏感試驗相媲美[2]。然而,此方案本身仍存在一些缺陷。首先,此方案僅適用念珠菌等酵母菌,尚不包括絲狀菌及雙相真菌,培養基不適合新生隱球菌的生長;其次,方法的操作較費時、繁瑣;由於真菌生長部分受抑製出現的拖尾現象,而使某些藥物終點的判定困難;此外,對於檢測一些耐藥株特別是兩性黴素B耐藥株方麵也不夠敏感。因此,M-27方案仍有待改進[3]。

NCCLS方案的微量稀釋法與大量稀釋法之間有較好的一致性,且具有操作簡便,僅需少量培養基和試劑等特點。已被列入M27-T方案中,但唑類藥物的終點判定方法仍不盡人意,缺乏統一的標準,尤其是5-FC和唑類藥物的拖尾現象,使結果的判讀比較困難且帶有主觀性[3]。

Etest法是一種新的利用瓊脂擴散技術進行的MIC測定法,它已廣泛應用於抗細菌藥物的體外藥敏測定方法[4]。其基本原理是用特殊技術將抗菌藥物在一試劑條上形成一個定量連續梯度,其培養基、菌接種濃度、培養溫度及時間等條件基本按照M-27方案所推薦的條件。自1993年起開始應用於酵母菌的抗真菌藥敏試驗[5-7],我國也已取得一些應用該技術的經驗[8],其具體操作程序如下。

1.將RPMI 1640+MOPS瓊脂(2%葡萄糖)培養基倒入平皿中製成平板備用。

2.用無菌棉簽將濁度為0.5McFarland的酵母菌菌液(新生隱球菌菌液濁度為1McFarland)從3個方向均勻塗布於瓊脂表麵,靜置15分鍾使平皿表麵晾幹。

3.將含有藥物的Etest條放置於瓊脂板表麵,注意不要移動試劑條。

4.35℃培養,念珠菌培養24小時,隱球菌培養48小時或72小時。

5.結果判定時讀取抑菌環最下端的抗真菌藥物濃度作為MIC終點的判定。

由於Etest法在真菌藥敏試驗中具有簡易方便,結果準確等特點,在抗真菌藥物的體外藥敏試驗方麵已顯示出廣泛的應用前景。

 

二、NCCLS方案法與Etest方法的敏感性、一致性比較研究

Etest法最早僅用於細菌藥敏的試驗,Bolmstrom等在實驗室做了許多研究證實該方法同樣適用於酵母菌的抗真菌藥敏試驗。他的主要研究是評價Etest作為一種抗真菌藥敏試驗工具的可行性。經過反複多次的研究發現嚴格按照操作程序規定的最佳條件Etest可獲得穩定的結果。

自1994年開始有不少學者將NCCLS方案與Etest方法對唑類藥物抗真菌MIC的一致性進行了比較研究。Espinel-Ingroff[6]在1994年采用Etest法和NCCLS方案大量稀釋法測定了氟康唑、5-氟胞嘧啶對10株質控菌株和78株臨床分離酵母菌株MIC值一致性比較研究。結果顯示:質控菌株10株有8株MIC值與NCCLS方案結果一致,有較好的一致性。78株臨床株,48小時觀察結果,兩種方法MIC總一致率在氟康唑為81%,5-氟胞嘧啶為94%,有較好的一致性。她認為Etest法是一個很有希望的可在臨床廣泛推廣的藥敏試驗。Sewell等[7]也在同年測定了氟康唑對238株酵母菌的MIC值並與M-27微量法和大量法比較,結果24小時,Etest法與M-27試管法的結果一致性在光滑球擬酵母菌為37%,熱帶念珠菌為56%,白念珠菌為93%,而其他念珠菌為90%,總一致率為76%。48小時結果在光滑球擬酵母菌為34%,熱帶念珠菌為67%,白念珠菌為79%,而其他念珠菌為97%,總一致率為71%。不同菌種所測結果符合率差異較大。Colombo等[9]用Etest法和NCCLS方案多量稀釋法測定氟康唑、伊曲康唑、酮康唑對100株臨床分離酵母菌的MIC值、MIC值一致率:酮康唑71%、氟康唑80%、伊曲康唑為84%,結果證實Etest與NCCLS液體培養基稀釋法有較好的一致性。Wanger等[10]的研究結果表明:Etest方法與NCCLS法一致率達95%~97%,同時發現24小時的結果一致性優於48小時,而且對采用NCCLS方案對兩性黴素B耐藥性檢測不敏感的念珠菌,Etest法也能容易地將其檢測出來。VanEldere等[11]也比較了用Etest、NCCLS大量法和比濁微量法測定氟康唑、兩性黴素B對念珠菌MIC的一致率。微量法和Etest結果判定在24小時以後。結果發現在兩性黴素B,NCCLS多量法與Etest結果一致率達89%,也就是說其終點的差異不高於兩個稀釋度。NCCLS多量法和比濁微量法之間的一致率為97%。比濁微量法與Etest結果一致率達90%。在氟康唑,NCCLS多量法與Etest結果一致率達96%,NCCLS多量法和比濁微量法之間的一致率為100%,比濁微量法與Etest結果一致率達98.5%。雖然24小時終點的結果變化較大,但與48小時結果比較一致性好,與Wanger等[10]觀察結果一致。他還注意到光滑球擬酵母48小時結果,Etest方法MIC值較NCCLS方法要低,但並不象Smel1[7]等所報告的那樣低(Smell結果氟康唑對球擬酵母的一致率為37%,而VanEldere結果為93%)。但以前所報道的氟康唑Etest結果普遍比NCCLS方法要低。兩性黴素B結果Etest方法也較NCCLS方法低。Espinel-Ingroff等[12]分別采用酪蛋白瓊脂和含2%葡萄糖的RPMI 1640瓊脂基用Etest法檢測伊曲康唑、氟康唑、5-氟胞嘧啶、酮康唑和兩性黴素B的MIC值,在不同實驗室間進行了試驗。檢測了83株念珠菌、隱球菌和光滑球擬酵母,結果顯示:酪蛋白培養基對於兩性黴素B、伊曲康唑、酮康唑,實驗室間一致性較好,分別為84%~90%;87%,94%~96%。而RPMI 1640培養基對氟康唑和5氟胞嘧啶的一致率較好,分別為96%~98%和80%,說明Etest是很有應用價值的酵母菌藥敏試驗方法,但仍需要尋找最佳的培養基配方和MIC終點判定標準來提高實驗室間的一致性。最近,Pfaller等[13]又用3種不同的培養基Etest法測定了402株臨床分離酵母菌對氟康唑的敏感性。結果表明Etest法測定氟康唑藥敏最好使用含2%葡萄糖的RPMI 1640培養基或酪蛋白培養基,而不宜使用Mueller-Hinton培養基。

Pfaller等[14]曾用Etest法進行了多中心試驗以驗證該法的重複性。同時為進一步比較Etest法與NCCLS法的一致性,為Etest檢測念珠菌建立質控標準。測定了兩株質控菌株熱帶念珠菌(ATCC22019)和克柔念珠菌(ATCC6258)對兩性黴素B、氟康唑、伊曲康唑、酮康唑和5-氟胞嘧啶的MIC值。在每個試驗室重複20次測定每株菌對每個藥的MIC值,4個研究室共獲得80個MIC值。對此結果進行分析比較,結果的總一致率為98%~100%(在3倍稀釋度範圍內),兩個質控菌株對5種藥物用Etest法所得MIC值與NCCLS法所得MIC值完全一致的有:兩性黴素B、伊曲康唑對克柔念珠菌,5-氟胞嘧啶、氟康唑、伊曲康唑對近平滑念珠菌完全一致,而酮康唑對克柔念珠菌,兩性黴素B、酮康唑對近平滑念珠菌的MIC值Etest法略高於NCCLS法(略高1個稀釋度)。本研究為Etest檢測念珠菌建立了暫定的一個質控標準[14]。

最近,Warnock等[15]為代表的工作小組也對Etest藥敏試驗進行了多中心觀察。共10個實驗室參加測試了18株念珠菌和2株新生隱球菌對兩性黴素B、氟胞嘧啶、氟康唑和伊曲康唑的藥敏性。由兩人分別讀結果。總的結果,對於兩性黴素B,一致率為88.5%,對氟胞嘧啶為94%,氟康唑為92%,伊曲康唑為79%。Etest結果有時將敏感株誤歸為耐藥株,因此,本試驗結果認為Etest比較適合念珠菌對兩性黴素B和氟胞嘧啶藥敏性的常規篩選試驗,而用於唑類則不大可靠,如發現唑類耐藥株,應用標準方法重新測定。

Velegraki等[16]研究了從粒細胞減少病人分離的白念珠菌各表型與其對伊曲康唑、氟康唑敏感性的關係。共分離出131株念珠菌,其中44株白念珠菌表現出四種表型:光滑型、不規則型、模糊型和點型。無論用NCCLS方案法和Etest法所得MIC值,表型為點型的菌株對氟康唑、伊曲康唑的MIC值都高於其他表型的白念珠菌,說明Etest法與NCCLS方案結果一致,提示臨床對點狀表型的白念珠菌治療中要重視有無耐藥發生。

Arikan等[17]用Etest、NCCLS微量法、顯色法和NCCLS大量法進行比較。采用自免疫低下患者分離的101株念珠菌進行檢測。3種替代方法與NCCLS大量法的一致率在兩性黴素B為86%~93%,在氟康唑為84%~89%。同時可顯示氟康唑對克柔念珠菌和光滑念珠菌的MIC值偏高。

 

三、Etest法在絲狀真菌藥敏試驗方麵的應用

為進一步擴大Etest的應用範圍,Mills和Wanger[18]研究了用Etest法檢測曲黴對5種抗真菌藥物敏感性試驗,結果顯示:全部真菌生長良好,在1~3天內,35℃培養產生了易於辨認的抑菌環,每株菌重複檢測MIC值都在2倍稀釋度範圍內,所有菌株對5氟胞嘧啶、氟康唑耐藥(MIC＞32μg/ml),酮康唑MIC值1.0~2.0μg/ml,對伊曲康唑,兩性黴素B的敏感性較強,MIC為0.25~0.5μg/ml,這些結果證實Etest有潛力做為絲狀菌敏感試驗的方法。最近,倍肯公司提供了有關絲狀真菌的Etest法實施方案[19],試驗菌株包括曲黴、鐮刀菌、根黴等,基本操作與酵母菌的Etest法相同,菌懸液的濃度通過比濁法0.5麥氏標準或分光光度計530nm條件下,調整其透光百分比確定,孵育條件為35℃、24~72小時,但是,不同的菌株要求不同的孵育條件,如鐮刀菌需在35℃孵育24~48小時,隨之室溫(約25℃)孵育24~48小時;對於根黴菌屬,孵育18~24小時即可,因為孵育時間過長會出現生長過度。該方案同時規定了質控株,但其在絲狀真菌方麵的應用,有待於進一步擴大受試株,總結經驗。

 

四、體外藥敏試驗結果與臨床療效的關係

眾所周知,MIC值與臨床療效之間的關係是非常複雜的,不能單純根據其MIC值來預測臨床療效,MIC值高低並不一定與臨床治療成敗一致。目前多采用動物試駁與臨床療效相結合的方法研究,關於體外藥敏試驗和臨床療效之間的關係有許多問題亟待解決。NCCLS方案準確性強、重複性好,但還不能將其作為常規的檢查方法,不能單純根據其MIC值來預測臨床療效[3]。早期研究認為在特定的臨床條件下,體外藥敏試驗能預測臨床療效,如接受氟康唑治療的口腔念珠菌病的AIDS患者,這組人群都患有同一原因所致的免疫缺陷,藥物對病原菌的MIC與療效之間的相關性較好。在比較複雜的情況下,如念珠菌血症病人,受試者本身的條件明顯影響臨床療效和MIC檢測結果之間關係,Ruhnke等[20]做了NCCLS法與Etest法兩種方法敏感性比較及與氟康唑臨床治療療效的比較研究,結果發現體外試驗結果與臨床療效有一定相關性,所有的白念珠菌是來自口腔念珠菌病病人。在較理想的受試條件下臨床對氟康唑治療無效者體外MIC值＞256μg/ml。對氟康唑治療有效病人分離的白念珠菌MIC值小於耐藥標準值,他認為用3種方法所做體外耐藥菌株與臨床治療失敗是一致的,說明Etest在檢測MIC值與臨床治療之間的關係方麵與NCCLS方法基本一致。最近,Pfaller等[21]又對Etest對酵母菌對兩性黴素B的體外藥敏性進行了評價,共采用了660株臨床分離株,Etest與NCCLS方法總一致性為98.3%,同時證明Etest方法對發現兩性黴素B耐藥株較NCCLS方法更為敏感。

綜上所述,在迅速進展的體外抗真菌藥敏試驗中,試驗方法的簡單化和標準化是研究的熱點,NCCLS方案推薦的藥敏試驗方法對真菌藥敏試驗的標準化起了巨大的推動作用,但由於它方法繁瑣,不適於做為實驗室的常規檢測項目。而Etest是一個較為簡便、可靠、準確的方法,無需特殊條件,可在一般實驗室用作藥敏檢測並可指導臨床用藥,是一個很有應用前景的臨床實驗室抗真菌藥敏試驗方法。

 

參考文獻

1 National committee for clinical laboratory standards.Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeast;Approved Standard M27-A.Lancaster Avenue,Villanova.Pennsylvania:NCCLS,1997.1-12.

2王文莉,王端禮,李若瑜,等.酵母菌的NCCLS藥敏試驗方法及其應用中華醫學檢驗雜誌,1997,20:119-122.

3 Pfaller MA,Rex JH,Rinaldi MG.Antifungal susceptibility testing:technical adnances and potential clinical applications.Clin Infect Dis,1997.24:776-784.

4王輝,陳民均.藥敏試驗的方法學研究進展.中華醫學檢驗雜誌,1997,20:342-345.

5 Bolmstrom A,Karlsson A,Mills K,er al.Antifungal susceptibility testing of yeasts with Etest,abstr 260.In:Program and Abstracts of the 33rd Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy.Washington D C:American Society for Microbiology,1993.167.

6 Espinel-Ingroff A.Etest for Antifungal susceptibility testing of yeasts.Diagnostic Microbiol Infect dis,1994,19:217-220.

7 Sewell DL,Pfaller MA,Barry AL.Comparison of broth macrodilution,vroth microdilution and E test antifungal susceptibility tests for fluconazole.J Clin Microbiol,1994,32:2099-2102.

8 沈定霞，謝靈，劉梅，等。酵母菌對氟康唑的敏感性及三唑類藥敏試驗方法的比較。中華醫學檢驗雜誌，1998，21：199-201.

9 Colombo AL,Barchiesi F,McGough DA,et al.Comparison of Etest and National Committee for Clinical Laboratory Standards broth macrodilution method for azole antifungal susceptibility testing.J Clin Microbial,1995,33:535-540.

10 WangerA,Mils K,Nelson PW,et al.Comparison of Etest and NCCLS broth macrodilution mehod for antifungal susceptibility testing:Enhanced ablity to detect ampnotericin B-resistant Candida isolates.Antimicrbial Agents and Chemotherapy,1995,39:2520-2522.

11 van Eldere J,Joosten L,Verhaeghe V,et al.Fluconazole and amphotericin B antifungal susceptibility testing by NCCLS broth macrodilution method compared with Etest and semiautomated broth microdilution test.Jclin Microbiol,1996,34:842-847.

12 Espinel-Ingroff A,Pfaller M,Erwin ME,et al.Interlaboratory evaluation of Etest method for testing antifungal susceptibilities of pathogenic yeasts to five antifungal agents by using Casitone agar and solidified RPMI 1640 medium with 2% glucose.J Clin Microbial,1996,34:848-852.

13 Pfaller MA,Messer SA,Karlsson A,et al.Evaluation of the Etest method for determining fluconazole susceptibilities of 402 clinical yeast isolates by using three different agar media.J Clin Microbiol,1998,36:2586-2589.

14 Pfaller MA,Messer SA,Bolmstrom A,et al.Multisete reproducibility of the Etest MIC method for antifungal susceptibility testing of yeast isolates.J Clin Microbiol,1996,34:1691-1693

15 Warnock DW,Johnson EM,Rogers TR.Multi-centre evaluation of the Etest method for antifungal drug susceptibility testing of Candida spp.and Cryptococcus neoformans.BSAX Working Party on Antifungal Chemotherapy.J Antimicrob Chemother,1998,42:321-331

16 Velegraki A,Papalambrou D,Soremi S,et al.Variable antifungal susceptibility of wild-type Candida albicans phenotypes from neutropenic hosts.Eur J Clin Microbiol Infect Dis,1996,15:854-860.

17 Arikan S,Gur D,Akova M.Comparison for Etest,microdilution and colorimetric dilution with reference broth macrodilution method for antifungal susceptibility testing of clinically significant Candida species isolated from immunocompromised patients.Mycoses,1997,40:291-296.

18 Mills K, Wanger A.Susceptibility testing of Aspergillus species using Etest.Etest yeast update,Dalvagen,Solna,Sweden:AB BIODISK,1997.678.

19 AB BIODISK.Etest technical guide 10.Dalvagen,Solna,Sweden:AB BIODISK,1997.171

20 ruhnke M,Schmidt-westhausen A,Engelmann E,et al.Comparative evaluation of three antifungal susceptibility test methods for Candida albicans isolates and correlation wiiith response to fluconazole therapy. J Clin Microbiol,1996,34:3208-3211.

21 Pfaller MA,Messer Sa,Bolmstrom A.Evaluation of Etest for determining in vitro susceptibility of yeast isolates to amphotericin B.Diagn Miceobiol Infect Dis,1998,32:223-227.