耐甲氧西林金黃色葡萄球菌檢測方法的比較

[關鍵詞]  金黃色葡萄球菌;甲氧西林;乳膠凝集試驗　

 

    耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）是臨床院感的常見致病菌，目前用於檢測的的紙片法雖然簡便，但其敏感性和準確率都不太理想。而PCR擴增mecA基因對試驗條件的要求又比較高。檢測mecA基因編碼產物PBP2a的表達將是判斷金黃色葡萄球菌對甲氧西林是否耐藥的最直接證據[1]。基於此基礎上的快速乳膠凝集檢測試劑盒在美國已經獲得FDA認證，但在我國此檢測方法還未普及。為了對這幾種檢測方法的敏感性、準確性有一個全麵的了解以尋求更準確、迅速、經濟的檢測方法，本實驗將對紙片檢測、基因檢測與蛋白質檢測方法進行比較。

 

　　1  材料與方法

 

　　1.1  材料

 

　　1.1.1  菌株來源：實驗菌株為十堰地區2003年5月~2004年6月間住院及門診各種臨床感染樣本中分離保存的52株金黃色葡萄球菌。對甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌標準參考菌株ATCC 25923由軍事醫學科學院微生物流行病研究所保存。

 

　　1.1.2  藥物紙片與檢測試劑盒:以苯氧西林藥物紙片代替甲氧西林藥物紙片，購自北京衛生部生物製品鑒定所；水解酪蛋白(M-H) 瓊脂為杭州天和生物有限公司產品；耐甲氧西林金葡菌快速乳膠檢測試劑盒購自英國oxoid公司。

 

　　1.1.3  引物設計與合成：從GeneBank中查到金黃色葡萄球菌mecA基因的全序列， 通過Array designer軟件設計相應的引物，MecA-F, 5'-CAAGATATGAAGTGGTAAATGGT-3'     MecA-R,5'-ACTGCCTAATTCGAGTGCTAC-3'送上海生物工程公司合成。DNA標準分子量標準購自北京天為時代公司。

 

　　1.2  方法

 

　　1.2.1  實驗菌株的確定：所有菌株均以常規方法培養分離，革蘭氏染色、血漿凝固酶試驗和生化試驗進行鑒定，確定為金黃色葡萄球菌。

 

　　1.2.2  紙片擴散法檢測:此方法為臨床檢驗科常用方法。苯唑西林含量為1 g/ 片,平皿中M-H 瓊脂厚度為4 mm ,菌液調至0.5麥氏濁度塗布於含20 g/L NaCl的M-H 平板上。在35 ℃環境下孵育24 h。抑菌直徑≤10 mm即判斷為耐甲氧西林菌株[2]。

 

　　1.2.3  PCR法檢測：取分離、鑒定為金黃色葡萄球菌的單個菌落，用無菌生理鹽水配成1個麥氏濃度，取菌懸液10 μl 100 ℃水浴10 min，15 000 rpm離心5 min後取上清5 μl作為mecA基因擴增的模板。擴增程序：94 ℃ 7 min, 94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 50 s經30個循環後，72 ℃ 7 min；擴增產物的檢測：取擴增產物10 μl於1.0%瓊脂糖（內含0.5 g/L溴乙啶）TBE緩衝係統進行電泳，在紫外光下檢測，在533 bp出現條帶樣本而陰性對照無則被認為陽性。

 

　　1.2.4  快速乳膠凝集檢測試劑盒檢測：將大約3～5 μl（約10～20個菌落）金黃色葡萄球菌懸浮於200 μl試劑盒所帶的提取液Ⅰ中，100 ℃加熱3 min，室溫下自然冷卻加入25 μl提取液Ⅱ，混勻後3 000 rpm室溫離心5 min，取50 μl上清液於對照圈，加入PBP2a無特異性單克隆抗體致敏的乳膠顆粒溶液25 μl，作為陰性對照；再取50 μl上清液於試驗圈中，加入25 μl 的PBP2a特異性單克隆抗體致敏的乳膠顆粒溶液；搖動3 min，於自然光下觀察有無凝集顆粒出現。試驗圈有凝集顆粒出現的菌株為陽性。

 

　　2  結果

 

　　結果見表1，在52株臨床分離出的金黃色葡萄球菌中，藥物紙片法與快速乳膠凝集試驗均檢測出26株甲氧西林耐藥的菌株，而PCR基因擴增的方法檢測出28株對甲氧西林耐藥的菌株，其中的26株菌三種檢測方法均證明為耐甲氧西林菌株。經過χ2檢驗表示3種檢測方法間的差異無明顯意義。

 

　　表1  三種方法檢測MRSA 的敏感性及特異性比較（略）

 

　　3  討論

 

　　本研究采用的乳膠結合試驗,是近2～3 年國外學者推出的檢測MRSA 的新方法。其基本原理是檢測細菌是否合成PBP2a 而判斷細菌是否為MRSA。此方法簡便、快速、準確,檢測1 份標本全部用時隻需15 min。對mecA 基因擴增陽性而PBP2a 檢測陰性的2 株菌再次利用乳膠試劑盒進行檢測,結果仍為陰性,可能與PBP2a 在這些菌株中的表達量低有關，提高待測細菌的量(挑取50個菌落)以及延長凝集反應時間(10min) 可提高陽性率,且不會因此而降低敏感性[3]。此試驗雖然表明3種檢測方法結果無明顯差異，但這可能是由於檢測的樣本數量有限所造成的。PCR法被認為是耐甲氧西林金葡菌檢測的"金標準"，但由於其對試驗條件要求比較高而且可能出現假陽性結果而不能在一些基層醫院開展。在實際工作中，紙片法操作比較簡單，設備簡單，價格便宜但可能會造成漏診，對紙片法檢測陰性的菌株再進行乳膠結合試驗將是指導臨床更好的選擇用藥、有效進行治療的手段。

李蓓， 劉晶靖， 孫競， 範金明， 朱怡， 熊琛  《鄖陽醫學院學報》 2006 年 2 月 第 25 卷第 1 期

    [參  考  文  獻]

　　[1]     Hiramatsu K,Cui L,Kuroda M.The emergence and evolution of methicillin-resistant Staphylococcus aureus[J].Trends Microbiol,2001,9(10):486-293.    

　　[2]     Gosbell IB,Neville SA,Mercer JL,et al.Evaluation of the MRSA-Screen Test in detecting oxacillin resistance in community and hospital isolates of Staphylococcus aureus[J].Pathology,2001,33(4):493-495.    

　　[3]     National Committee for Clinical Laboratory Standards. Perform～ance standards for antimicrobial susceptibility testing[S]. Approved standard-seventh edition M100-S10(M7). Pennsylvania: NCCLS, 2000.

　　（鄖陽醫學院微生物教研室 ；附屬太和醫院 ；鄖縣人民醫院，湖北 十堰  442000）