淺談實驗室細菌菌種的保存

 在微生物學、環境科學、分子生物學、毒理學、酶學、疫苗製備、藥品生產等等領域的實驗過程中，都需要應用各種細菌，儲備標準菌種、參考菌種、特殊菌種是必不可少的，下麵就幾種實驗室菌株的保存方法簡述如下。

    1  斜麵低溫保存法

 

    將分純的待存菌接種於適宜的固體斜麵培養基上，得到充分生長後，用封口膜封口，貼上標簽，保存於4℃的冰箱中。此法操作簡單、使用方便、不需要特殊設備，是實驗室菌種保存最常用的方法。但保存時間短，一般每個月都要移種1次，而且菌種容易變異，所以此方法隻適合實驗室短期實驗菌株的保存。

 

    2  半固體瓊脂法

 

    用接種針將以分純的待存菌，穿刺接種於半固體中，放入培養箱培養後取出，封上無菌的液體石蠟，貼上標簽，放4℃冰箱保存。此方法簡便易操作，不需特殊設備、技術難度不大，但保存的時間不長，一般隻能保存1年以內，而且對抵抗力弱以及一些特殊菌種大概隻能存活3～6個月，需要頻繁的傳代，這樣很容易使菌株受到汙染、變異。所以此方法不適用菌種的長期保存，隻適合實驗室一些要求不高的菌種的短期保存。

 

    3  液體石蠟保存法

 

    將液體石蠟滅菌，放於37℃恒溫箱中，使水汽蒸發掉備用。再將已分純的待存菌在最適宜的斜麵培養基中培養，使得到健壯的菌體，用無菌吸管吸取已滅菌的液體石蠟，注入已長好的斜麵培養基上，用量以高出斜麵1cm為準，將試管直立，貼上標簽，置4℃下保存。此法製作簡單，不需要特殊設備，菌種可以保存1年左右不需要經常移種，缺點是保存的時候需要直立放置。此方法適合實驗室短期菌株的保存，而且保存時需要一定的空間［1］。

 

    4  高層半固體瓊脂石蠟保存法

 

    將待存菌經平板劃線分離後，挑單個菌落用接種針反複穿刺接種到高層半固體瓊脂培養基中，經培養箱培養後取出，用滅菌過的液體石蠟滴加到半固體瓊脂菌種管表層約0.5cm高度，貼上標簽，存放4℃冰箱。此法操作簡便，不需要特殊設備，效果好，可以保存菌株1～2年。所以適合實驗室菌株的較長期的保存［2］。

 

    5  紙片法

 

    將已分純的待存菌用無菌鑷子鑷取紙片，在紙片上刮取4～5個菌落，放入凍存管內，蓋上蓋子後用封口膠布封住邊緣，貼上標簽，放入冰箱冷凍保存（－20℃左右）。此方法具有操作簡單、不需特殊設備、經濟實用、保存空間小等，而且保存時間至少2年，但對一些營養要求比較高的菌種，存活率不理想。所以此方法適合實驗室一些營養要求不高的菌種較長時間的保存［3］。

 

    6  甘油液保存法

 

    將已分純的待存菌接種於肉湯中，37℃培養18～24h，然後按5份肉湯溶液、2份甘油－生理鹽水保存液的比例分裝於滅菌的微量離心管或細胞凍存管中，貼上標簽，置－80℃～－20℃冰箱保存。此法操作簡便，不需要特殊設備，效果好，可以保存菌種3年左右，無變異現象，而且此方法還可以保存一些要求較高的特殊菌種，適用範圍廣。所以此方法適合實驗室普通菌種或特殊菌種的較長期的保存［4］。

 

    7  濕牛奶凍存法

 

    將待存菌種於各自生長良好的平板培養基上，經分純後放入培養箱培養。用準備好的保護劑牛奶洗下菌苔，再用無菌毛細滴管吸取菌懸液滴入菌種管球部，每管球部約有一半的菌液，之後火焰封口，貼上標簽，保存於－20℃冰箱。此方法操作比較簡便，不需特殊設備、不需要花費很多時間，而且保存時間大約3年，時間較長，不易變性，也不容易汙染。所以此方法適合實驗室菌種較長時間的保存［3］。

 

    8  蒸餾水保存法

 

    取滅菌蒸餾水6～7ml加於已接待存菌斜麵培養基的試管內，用吸管研磨，洗下斜麵上的菌苔，充分混勻，將此菌液分裝於滅菌的螺旋小瓶中，或用膠塞密封，貼上標簽，置於4℃保存。此法製作簡單，不需要特殊設備，且不需要經常移種，而且可以保存數年，但要注意保存的時候需要直立放置。所以此方法適合實驗室菌種的長期保存［4］。

 

    9  冷凍真空幹燥法

 

    將待存菌分純後，用準備好的保護劑牛奶洗下菌苔，把菌懸液滴入菌種管後，在管口抽取少許棉花塞入管內細頸處，放入冰箱－40℃速凍40min，放入準備好的混有鹽的冰中，接上真空泵，真空抽幹呈粉末狀，火焰封口，貼上標簽，保存於－40℃冰箱。此法保存時間長，可達15年，不易變性，但需要專用儀器，一般實驗室難以配備，而且過程複雜，操作難度大，需要較長時間才能完成。所以此方法適合具有條件的實驗室菌種的長期保存［3］。

 

    10  小結

 

    綜上所述，我們在做實驗過程中或者短期保存菌種時，可以選擇斜麵低溫保存法、半固體瓊脂法、液體石蠟保存法、高層半固體瓊脂石蠟保存法、紙片法，進行保存；如果需要較長時間的保存菌株，可以選擇甘油液保存法、濕牛奶凍存法、蒸餾水保存法、冷凍真空幹燥法保存菌株，其中冷凍真空幹燥法需要實驗室配備好相應的儀器設備。如果一些菌株營養要求比較高的話，可以選擇甘油液保存法、冷凍真空幹燥法保存。當然上述菌株保存的方法不是最理想、最方便的保存法，還需要我們不斷的探索，不斷的研究，找到一種或幾種簡單、方便、時間長的保存方法。

作者：張曉雷， 董小青， 王丹敏

作者單位：300162 天津，武警醫學院微生物教研室

 

【參考文獻】

  1 胡海林，郭維植．細菌實驗菌種的保存及管理．福建醫藥雜誌，2000，22(1)：113．

2 陳秀英．菌種保存方法的比較．中國衛生檢驗雜誌，2002，12(2)：231.

3 葉迎春，趙世鴻，淩體淑. 3種菌種保存法比較. 中國誤診學雜誌， 2004,4(3):386.

4 黃霞雲．菌種保存方法的改進．廣東醫學院學報，1999,17(1)：7.