1907年，捷克學者Halberstaeder和Prowazek發現沙眼包涵體，1956年我國學者湯飛凡等分離沙眼衣原體成功，引起了全世界對其進行廣泛深入的研究［1］。沙眼衣原體(chlamydia trachomatis, Ct)與人類疾病關係密切，且目前已成為許多國家和地區常見的性傳播疾病病原體，日益引起人們重視。Ct感染的診斷決定於病原學檢查。隨著檢測技術的進展，Ct感染的診斷也不斷地發生變化。我們就此領域的研究進展作一簡述。
一、細胞生物學檢測方法
1.塗片鏡檢：Ct寄生於柱狀上皮細胞內形成包涵體，取宮頸或尿道標本塗片後，通過碘染色或姬姆薩染色等可見細胞內包涵體。但由於泌尿生殖道中完整細胞較少，以及細胞內包涵體脆性較大，從而造成敏感性過低，不推薦用於臨床標本的檢查，僅限於Ct的鑒定［2］。
2.細胞分離培養法：由於Ct的專性細胞寄生性，一般培養法不能使其生長，隻有在活的細胞內才能增殖、複製。組織細胞培養法分離Ct多采用McCoy細胞或 Hela-229細胞（國內也有報道采用Hep-2細胞），染色後在顯微鏡下觀察細胞內有無包涵體。早期曾試圖用尿標本做培養，但陽性率甚低［3］，隻能采用尿道或宮頸拭子。培養法的特異性為100%，但敏感性一般低於100%，且各個實驗室操作步驟有所不同，沒有標準化，這可能有助於解釋對同一種非培養方法的不同評價。組織細胞培養法是診斷Ct感染的“金標準”［4］，但是由於分離培養操作複雜，技術及設備要求高，所需時間長，且敏感性受標本采集、運送、保存等的影響較大［5］，加上國內很多醫院不具備細胞培養條件，因而不適於臨床應用，多用於科研和疑難病例的終鑒定。
二、免疫學檢測方法
1.直接熒光抗體測定（DFA）：將針對Ct的單克隆抗體用熒光標記，與標本中的Ct結合後，熒光顯微鏡檢查就能見到發熒光的原體（Ebs）。針對脂多糖（LPS）的抗體熒光不夠亮，且染色不勻；而針對主要外膜蛋白（MOMP）的抗體熒光更亮，且減少非特異染色［6］。DFA不象培養法必須存在有活力的Ct，但其敏感性受人群感染率的影響，且有判定結果帶有主觀性，熒光易淬滅，不適於檢測大量標本等缺點。多數學者報道其特異性較高，Hallsworth等［7］報道可達100%，因此在科研中常被用作確證試驗。由於此法操作簡便、費用低廉，在不具備分子生物學試驗條件的醫院，可用以檢測臨床標本［8］，但也需經驗豐富者操作。
2.酶免疫測定（EIA）：用酶標記的單克隆或多克隆抗體檢測Ct的LPS或MOMP，酶反應生成有色產物，用酶標儀進行測定。目前有Chlamydiazyme、ID-EIA、Pharmacia Chlamydia EIA等多種市售診斷試劑盒可供使用。其敏感性從64%到98%，特異性從93%到98%［9］。通常認為，其敏感性在高危人群中可得到滿意結果，而在新近感染及治療監測中敏感性明顯下降。EIA的優點在於方法簡便、操作自動化，適於短時內大批量標本的檢測。但其最大缺點在於，與其他常見微生物產生交叉反應，如金黃色葡萄球菌、A群及B群鏈球菌、淋病奈瑟菌、醋酸鈣不動杆菌、肺炎克雷伯菌及其他革蘭陰性細菌，從而使特異性達不到100%。國外此法多用於高危人群的篩查，國內應用較少。
三、分子生物學檢測方法
1.直接檢測核酸的技術（即基因探針技術）：此技術利用核酸分子的複性原理，用特定的標記探針去檢測標本中的靶核酸。最初為放射性標記，後來逐漸發展為酶或化學發光試劑標記。目前有美國聖地亞哥Gen-Probe公司生產的發光標記基因探針試劑盒PACE-2。與培養法相比，Gen-Probe方法的敏感性和特異性分別為73%～96%和98%～99%［9］，尚無培養法敏感和特異。由於此法成本高、步驟繁瑣，隨著核酸擴增技術的出現，基因探針技術也就失去了其應用價值。
2.核酸擴增技術：繼基因探針技術之後，很快出現了核酸擴增技術，這些技術包括（1）靶DNA或RNA的擴增，如聚合酶鏈反應(PCR)，基於轉錄的擴增(TBA)，自動維持序列擴增(3SR) 以及鏈置換擴增(SDA)；（2）探針擴增，如連接酶鏈反應(LCR)，Q-β複製酶的擴增；（3）雜交後信號的擴增，如複合探針和分支DNA探針。其中研究和使用較多的是PCR和LCR，尤其是PCR技術，有學者認為其將對感染診斷引起革命性變化［10］。
PCR屬於一種核酸體外擴增技術，用寡核苷酸指導的DNA合成的重複循環來實現對靶核酸序列的擴增。PCR每個循環包含變性、退火、延伸3個步驟，在不到2小時內，經過30個循環，在理論上可將最初的靶DNA擴增109倍。最後可用凝膠電泳或探針雜交檢測擴增的DNA。由於先將標本中的核酸特異成分先行擴增複製再行檢出，其敏感性較直接檢測核酸大大提高。
目前國內外用於構建引物的衣原體DNA有7.5Kb質粒、MOMP基因（omp1）和16SrRNA基因。診斷試劑盒AMPLICOR Ct PCR已通過食品與藥品管理局(FDA)的審批，其擴增靶序列即為質粒DNA。許多研究都已表明，PCR較培養法和EIA法都要敏感［7，9，11］，而且PCR對於有症狀或無症狀人群同樣敏感［3］。但基於不同引物的PCR的敏感性仍有所不同。Roosendaal等［12］的研究表明，質粒引物PCR最敏感，omp1引物PCR最不敏感，16SrRNA基因引物PCR介於兩者之間。這可解釋為在每個衣原體細胞中DNA拷貝數不同的緣故。雖然omp1引物PCR敏感性較質粒PCR為差，但omp1引物PCR擴增的特異性好，而且Palmer等［13］報道通過巢式PCR，經過2輪擴增，同樣能夠達到質粒引物PCR的敏感性。並且omp1擴增後，利用限製性片段長度多態性（RFLP）還可對Ct進行基因分型［14］，這對流行病學調查具有重要意義。
PCR技術不但能檢測尿道或宮頸拭子標本，而且可以采用尿標本進行檢測。但尿中可能存在擴增的抑製物，從而影響PCR的敏感性。Verkooyen等［15］報道將標本進行預先的加熱處理或使用2SP轉運培養基可顯著降低AMPLICOR Ct PCR對抑製因子的易感性。將臨床標本加熱處理後10倍稀釋亦可在很大程度上防止這種抑製。除了尿中的抑製物會影響PCR的敏感性，導致出現假陰性結果外，PCR的另外一個缺點是由於其本身技術原理的原因，容易造成假陽性汙染。
近年亦有學者應用LCR檢測Ct。LCR屬於一種探針擴增技術，是依賴靶核酸序列的寡核苷酸探針的連接技術。Abbott LCR-CT診斷試劑盒也已通過FDA的審批。同PCR相比，由於使用兩對引物，用LCR檢測Ct感染，具有更高的敏感性和特異性［16］。但連接酶價格昂貴，難以在臨床普及應用，僅適用於科研，且國內應用較少。
最新發展的擴增試驗是Gen-Probe公司的擴增Ct的轉錄介導擴增試驗（TMA），擴增並檢測Ct的rRNA。TMA的一個優點是每個感染細胞中有大量的rRNA。而且操作步驟簡便，隻是一個恒溫過程，不需要變換溫度的擴增儀。Crotchfelt等［17］報道TMA檢測女性尿標本的敏感性和特異性分別為93.8%和100%，男性尿標本為95.6%和98.7%，提示TMA將成為另外一種能利用尿標本檢測Ct的擴增方法。國內尚無采用該法進行檢測的報道。
目前除了發展各種核酸擴增技術，國外學者們又將眼光投向了標本取材方麵的改進上。除尿標本外，外陰標本也可能作為一種非侵入性標本而適用於PCR、LCR和TMA等高度敏感的擴增方法，在篩查高危人群中可能會替代侵入性標本［18］。測試外陰塗片標本可以節省用於尿標本離心的時間，而且可以由患者自行取材［19］。另外，為節省時間和費用，有學者嚐試，同時進行幾種性傳播疾病病原體的共同擴增，但結果不盡如人意［20-22］。
綜上所述，結合國內情況，泌尿生殖道Ct感染的實驗診斷中，經典的細胞培養方法雖然特異，但耗時長、費用大，且不夠敏感，不適於臨床開展；免疫學方法簡便快捷，在基層醫院具有實用性；在具備分子生物學實驗條件的醫院，由於PCR方法高度敏感特異，可檢測各發病率人群，隻要嚴格規範操作，避免假陰性及假陽性結果的出現，可望在Ct感染診斷中常規使用。總之，Ct感染的診斷目前已發展到分子生物學水平，隨著科學技術的不斷進步，下個世紀有可能利用生物芯片等更新的技術進行檢測。我們應密切注視檢測技術的發展，以便準確、快速地對Ct感染作出診斷。
作者：楊婧 張正 中華醫學檢驗雜誌 作者單位：100044 北京醫科大學人民醫院檢驗科
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