摘 要 目的：比較不同方法檢測金黃色葡萄球菌對萬古黴素敏感性試驗結果。方法：將1株從臨床標本中分離的異質性耐萬古黴素的金黃色葡萄球菌（h－VRSA）在含有不同濃度的萬古黴素培養基上連續轉種誘導，得到一係列對萬古黴素不同程度耐藥的菌株，分別用瓊脂篩選法、微量肉湯稀釋法、E－test法、紙片擴散法和儀器法對萬古黴素的敏感性進行檢測。結果：瓊脂篩選法、微量肉湯稀釋法和E－test法可以檢測出金黃色葡萄球菌對萬古黴素中介耐藥（VISA），而紙片擴散法和儀器法則不能檢出VISA。結論：微量肉湯稀釋法和E－test法是檢測金黃色葡萄球菌對萬古黴素敏感性可接受的方法。若以紙片擴散法和儀器法為常規藥敏試驗方法的實驗室應增加含6μg/ml的萬古黴素腦心浸液肉湯進行篩選，以加強對VRSA和VISA的監測。
The evaluation of methods for detecting susceptibility of Staphylococcus aureus to vancomycin
MA Xiao－ling，ZHANG Tao，DAI Yuan－yuan，CHEN Jjian－zhong
（Department of Clinical laboratory，Anhui medical university affiliated Anhui Provicial Hospital，Hefei 230001，China）
ABSTRACT
OBJECTIVE：To investigate the effective methods for detecing susceptibility of Staphylococcus aureus to vancomycin.
METHODS：A isolate of h－VRSA isolated from clinical specimen was inoculated on the increasing concentration of vancomycin agars. Vary degree vancomycin resistant S. aureus were obtained. The susceptibility of these S. aureus to vancomycin were tested by agar screening test，broth microdilution method，E－test，disk diffusion method and automated methods.
RESULTS：Agar screening test，broth microdilution method and E－test can detect the vancomycin－intermediate S. aureus（VISA），but disk diffusion method and automated methods can not detect VISA.
CONCLUSION：Broth microdilution method and E－test are acceptable methods for susceptibility testing of S. aureus to vancomycin. Laboratories using automated methods and disk diffusion method as routinely susceptibility test should consider adding a vancomycin agar screen plate to enhance detection of VRSA and VISA.
Key words：Staphylococcus aureus；vancomycin；resistance；methods
耐萬古黴素金黃色葡萄球菌的出現是臨床抗感染治療中非常棘手的問題，為了防範這一嚴重耐藥菌在醫院內迅速傳播，2005年美國臨床和實驗室標準化研究所（CLSI/NCCLS）[1]的“抗生素敏感性試驗執行標準”中增加了萬古黴素耐藥金黃色葡萄球菌（VRSA）和萬古黴素中介耐藥金黃色葡萄球菌（VISA）的檢測方法和判斷標準。本文使用體外誘導方法在實驗室內構建一係列對萬古黴素不同程度耐藥的金黃色葡萄球菌菌株，並用於對萬古黴素藥敏試驗方法進行評價。
1. 材料和方法
1.1 菌株 臨床標本分離的金黃色葡萄球菌，經菌譜分析法確定為異質性萬古黴素耐藥的金黃色葡萄球菌（h－VRSA），編號為10827[2]。金黃色葡萄球菌標準菌株ATCC29213、ATCC25923和糞腸球菌標準菌株ATCC51299購於中國藥品生物製品檢定所。
1.2 藥物 鹽酸萬古黴素由美國禮來公司生產，有效期內使用，使用前用金葡菌標準菌株ATCC29213進行質控。
1.3 培養基及藥敏紙片 腦心浸液培養基（BHIA）和萬古黴素藥敏紙片由英國Oxoid公司生產，E－test藥敏板條由瑞典AB biodisk公司生產。
1.4 儀器 Vitek32微生物分析儀（法國，生物梅裏埃公司）；Microscan WalkAWay－40微生物分析儀（美國，德靈公司）。
1.5 方法
1.5.1誘導方法 將試驗菌株（10827）依次接種於4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml、32μg/ml和64μg/ml的萬古黴素MH培養基，每一個濃度傳代3次，不同萬古黴素濃度上生長的菌落分別命名為10827－4R、10827－8R、10827－16R和10827－32R。
1.5.2 菌譜分析 取金黃色葡萄球菌標準菌株ATCC 29213和10827及其誘導菌株采用直接菌懸液法配製到0.5麥氏濃度（細菌計數約為108CFU/ml）。以此菌懸液作連續10倍稀釋，取每個濃度菌懸液100μl，分別劃線接種到含萬古黴素0～64μg/ml的梯度BHIA中，35℃孵育48h，進行菌落計數，並取菌落數lg對數作菌譜分析圖。
1.5.3 CLSI/NCCLS推薦的篩選方法[1]將10827及其誘導菌株采用直接菌懸液法配製到0.5麥氏濃度，取10μl接種於含6μg/ml萬古黴素的BHIA，接種麵積直徑為10～15 mm，35℃孵育，24h觀察結果，有1個以上菌落或薄膜狀生長判斷為陽性，取生長的菌落重新鑒定，以保證為純培養的金黃色葡萄球菌，同時用手工方法檢測細菌的MIC，如MIC＝8～16μg/ml可報告為VISA，MIC≥32μg/ml可報告為VRSA。
1.5.4 Hiramatsu等[3]報道的篩選方法 菌液的準備和接種方法同1.5.3，篩選平板采用含4μg/ml萬古黴素的BHIA。接種菌液量為10μl，35℃孵育，24h內有菌落生長，為可疑VISA，24～48h細菌生長，為可疑h－VRSA。挑取可疑菌落，進一步檢測細菌的MIC以證實。
1.5.5 肉湯稀釋法藥敏試驗 按NCCLS M7－A5所提供的方法配製係列萬古黴素溶液，萬古黴素係列倍比稀釋濃度為0.12～256 μg/ml，每孔加100μl。取金黃色葡萄球菌標準菌株ATCC 29213和10827及其誘導菌株采用直接菌懸液法配製到0.5麥氏濃度，用肉湯將上述菌液進行1：100稀釋（106CFU/ml），分別取100μl接種物，加入裝有1ml萬古黴素肉湯稀釋液的各支試管和一支不含抗菌藥物的生長質控管中，混勻，最終菌液濃度為5×105CFU/ml，35℃孵育，24h觀察結果。
1.5.6 E－test法[4] 取金黃色葡萄球菌標準菌株ATCC 29213、10827及其誘導菌株采用直接菌懸液法配製到0.5麥氏濃度，均勻塗布接種於BHIA平板，待平板表麵幹燥，用鑷子將E－test試條放在已經接種細菌的平板表麵，並使試條全長與瓊脂平板緊密接觸，試條MIC刻度麵向上，35℃孵育，分別於24h和48h後讀取橢圓形抑菌環與E試條交界點的抑菌濃度（MIC值），同時觀察抑菌環內有無菌落出現並對其分純後重新鑒定。
1.5.7 紙片擴散法 取金黃色葡萄球菌標準菌株ATCC 25923、10827及其誘導菌株采用直接菌懸液法配製到0.5麥氏濃度，用無菌棉拭蘸取菌液均勻塗布接種於MH平板，待表麵幹燥，用無菌鑷子將紙片貼於瓊脂表麵並輕壓，使紙片與瓊脂表麵完全接觸，35℃孵育，整24h觀察結果。
1.5.8 儀器法 采用法國梅裏埃公司的Vitek32和美國德靈公司的Microscan WalkAWay－40微生物分析儀分別對ATCC29213、10827及其誘導菌株進行藥敏試驗檢測，操作方法按儀器說明書進行，結果由儀器自動判斷。
2. 結果
2.1菌譜分析 10827為1株臨床分離的金黃色葡萄球菌，表現為異質性耐藥，即用肉湯稀釋法檢測MIC為2μg/ml，但在含4μg/ml萬古黴素的BHIA上有細菌生長，該生長菌的MIC為8μg/ml。圖1顯示，隨著萬古黴素誘導濃度增加、誘導時間延長，曲線上抬、右移，由異質性耐藥向同源性中介耐藥和耐藥發展。
2.2 藥敏試驗結果 表1所示，瓊脂篩選方法、肉湯稀釋法和E－test法可以有效地檢測金黃色葡萄球菌對萬古黴素的敏感性，但儀器法和紙片擴散法，則不能檢測。
3. 討論
不同檢測方法對VISA的檢測結果的差異，可能與以下因素有關：（1）檢測時間：Marlowe等[5]發現VISA與萬古黴素敏感的金黃色葡萄球菌（VSSA）比較，生長速度明顯減慢，通常在18h內不出現肉眼可見的菌落，需要孵育整24h，甚至48h。而Vitek32對試驗菌株藥敏試驗的平均報告時間為11h，Microscan WalkAWay－40的平均報告時間為13h。（2）VISA的易回複性：日本學者Cui等[6]將16株來自於世界各國的VISA菌株在不含萬古黴素的培養基上連續傳代，發現VISA易失去對萬古黴素的耐藥性，但仍然保留有對萬古黴素異質性耐藥的亞群。所以Cui等[6]提出h－VRSA可能是細菌在某些抗生素（如萬古黴素、β－內酰胺類抗生素等）作用下誘導突變的結果，是穩定的；而VISA則可能是h－VRSA在萬古黴素壓力下選擇性的結果，是不穩定的，一旦萬古黴素選擇性壓力去除，VISA可回複為h－VRSA。（3）培養基的營養成分：Cui等[7]發現，VISA有明顯的營養依賴性，他們認為VISA對萬古黴素的耐藥主要依賴增厚的細胞壁[10]，如果在培養基中加入豐富的細胞壁成分，如氨基酸和葡萄糖後，細菌的耐藥性可以增加。本次試驗表明，使用營養成分較高的BHIA檢測效果較好。Cui等[7]報道如果在MH瓊脂中加入20％的馬血清，檢測效果與使用BHIA相同。
前期的研究證明10827原代為h－VRSA菌株[2]，表1所示，該菌株僅可用含4μg/ml萬古黴素BHIA檢出。有關h－VRSA檢測的意義目前尚有爭論，但越來越多的學者[8]認為h－VRSA可能是VISA的前身。Takayama等[9]對1例心內膜炎患者使用萬古黴素治療不同時期分離的5株MRSA菌株進行藥敏分析，結果顯示，初次分離的MRSA菌株為h－VRSA，在萬古黴素治療過程中，耐藥性逐漸增加，發展為VISA，並且最終導致治療失敗。圖1所示，10827菌株在萬古黴素選擇性壓力下，耐藥性迅速增加，發展為VISA/VRSA，所以積極開展h－VRSA檢測，對預防和控製VISA/VRSA的產生和傳播有重要意義。
作者：馬筱玲1，張濤2，戴媛媛1，陳建中3（1.安徽醫科大學附屬省立醫院，安徽合肥 230001；2.蚌埠醫學院微生物教研室，安徽蚌埠 233003；3.安徽衛生職業技術學院，安徽合肥 230061）
參考文獻
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8. Ruef C. Epidemiology and Clinical Impact of Glycopeptide Resistance in Staphylococcus aureu. [J]. Infection 2004；32（6）：315–327
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10. 馬筱玲. 萬古黴素敏感性減低的金黃色葡萄球菌.[J]. 中華檢驗醫學雜誌，2004，27（9）：620－622.
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