傷寒杆菌O抗與H抗血清的製備及其應用

在微生物實驗課教學中,肥大反應(widal stest)被列為本科臨床專業學生實驗的必修內容之一。近年來,由於抗生素的早期應用,臨床隨機采集的患者血清標本抗體含量很低,實驗中很難出現典型的抗原抗體凝集現象,由於實驗要用到抗血清,而抗血清又難以買到,價格也昂貴,為了節約經費，使用方便，我們嚐試了自製抗血清，並且在實驗教學中，通過製備抗血清進行抗原抗體之間免疫學反應，使學生獲得有關抗原、抗體、抗原抗體間的免疫反應這些抽象的免疫學的基本知識，使教學獲得了較好的效果。

 

　　1  材料與方法

 

　　1.1  動物的選擇  實驗動物為家兔，體重1.5 kg/隻~2.0 kg/隻。

 

　　1.2  抗原的製備傷寒杆菌的抗原製備  采用北京生物製品鑒定所提供的國內標準菌株傷寒杆菌“O”接種在普通瓊脂平板上約20隻～30隻，置37 ℃培養18 h～24 h，取培養物作塗片，並行革蘭染色，經顯微鏡觀察應均為革蘭陰性杆菌的純培養物，並作生化鑒定，葡萄糖(+)、乳糖(-)、靛基質(-)、尿素(-)、動力(+)，並用傷寒診斷血清“O”作玻片凝集，出現顆粒凝集確診為傷寒杆菌“O”抗原,如有汙染雜菌的平板應棄去，而純培養的平板加5 ml～6 ml無菌生理鹽水，用L型玻棒刮下菌苔，離心沉澱（2 500轉/min，10 min），同法用無菌生理鹽水洗滌兩次，棄上清，取沉澱物加適量滅菌生理鹽水配成30億/ml的菌液［1］，並按菌量加入0.3%～0.5%甲醛作防腐，置37 ℃作用30 min進行殺菌處理，即為傷寒杆菌“O”菌液，置4 ℃冰箱備用。傷寒杆菌“H”菌液的製備［1］，方法同傷寒杆菌“O” 抗原製備，此菌株也來自北京生物製品鑒定所。

 

　　1.3  免疫動物的方法［2］  實驗動物為家兔，共12隻，分別注射傷寒杆菌“O”、“H”菌液各6隻，程序見表1。表1：免疫注射程序日期（略）    

 

　　2  結果與保存

　　

　　2.1  抗血清效價測定與保存  於末次免疫1周後在耳緣靜脈采血2 ml分離血清，抗血清效價測定采用試管凝集法（肥大反應），用生理鹽水作血清稀釋液，倍比依次稀釋血清，置37 ℃ 24 h後觀察結果，以呈現++凝集的血清最高稀釋倍數作為血清凝集的效價。達到理想的抗體效價後采用心髒采血收集血清分裝成小瓶，每瓶約3 ml~5 ml，做好標記，置-20 ℃冰箱保存。

 

　　2.2  試管凝集實驗  將10個潔淨凝集試管，依次加0.5 ml生理鹽水,取1∶400稀釋的傷寒杆菌抗血清0.5 ml(血清稀釋視抗血清效價而定,效價高稀釋倍數就高，教科書上抗血清稀釋倍數一般從1∶40開始)，加入1號管,混勻後,取0.5 ml加入2號管,混勻,取0.5 ml加入3號管,依次稀釋,8號管混勻後吸0.5 ml棄去,10號管為對照管,從10號管開始,從後向前依次加入0.5 ml傷寒杆菌均“O”“H”菌懸液（7億/ml）［1］，各管混勻，置37 ℃靜置24 h，使抗原抗體充分反應，判斷效價見表2，以呈現50%凝集，出現“++”（上清液稍渾濁，凝集物明顯）的最高血清稀釋倍數為血清的效價。表2：傷寒杆菌“O”、“H”抗血清凝集效價測定（略）菌液+0.85%鹽水-免疫6隻家兔傷寒杆菌抗血清的平均幾何效價，傷寒“O”抗血清為1∶16 060，“H”抗血清為1∶25 600（見表3）。將“O”“H”抗血清按一定比例混合後，血清適當稀釋代替傷寒病人血清，可得到理想的實驗結果。表3：傷寒杆菌“O”、“H”抗血清幾何平均滴度免疫途徑（略）實驗注意事項：細菌的培養要無菌操作，不能混入雜菌。所選用的兔子要預先用傷寒杆菌“O”、“H”菌液做抗體檢測，不能選用已有抗傷寒杆菌“O”、“H”抗體的兔子。在免疫兔子時注意注射器的滅菌消毒，針頭是否堵塞。注射耳緣靜脈時，先用酒精將耳緣靜脈來回擦，使它充血增粗，易於注射。在兩次耳緣靜脈注射後，兔子可能會出現身體不適，有拉稀或耳朵腐爛等症狀，可減少注射量和次數，等好些再注射。收集血清時，將血液置於幹燥的培養皿中，放4 ℃冰箱過夜，次日用滴管吸取，避免震動，以免溶血影響血清質量。

 

　3討論

 

　　經過幾屆學生的實驗，作者認為自製的抗血清實驗效果好，使用方便，隨用隨取。這樣避免了因實驗材料的購買困難而影響實驗課的開設，能保質保量地完成實驗教學任務。經濟效益較高，購買的抗血清價格昂貴且效價不高，而自製的抗血清不需要耗費太多的材料，可為學校節約實驗經費。自製的傷寒杆菌抗血清還可用於血清學的凝集反應，即用已知的傷寒杆菌抗血清與傷寒杆菌菌懸液10億/ml結合，形成抗原抗體複合物，使學生對抗原、抗體抽象的概念得以了解，也可以觀察感覺到它的客觀實在，是一個建立免疫學概念的好實驗。

作者：蔡玲斐   《實用醫技雜誌》(杭州師範學院，浙江杭州 310018)

 

　　參考文獻：

 

　　［1］  揚履渭.微生物學及檢驗技術（沙門氏菌屬）［M］.廣州：廣東科技出版社，1992，4：155.

　　［2］  蔡玲斐.不同免疫途徑製備傷寒抗血清效價的比較［J］.杭州醫學高等專科學校學報，2002，23(3)：106.