幽門螺杆菌(Hp)與胃炎、消化性潰瘍、胃癌、胃淋巴瘤等關係密切。Hp在我國普遍人群的感染率約50%~80%,可經口傳播。如何預防和根除Hp感染是目前臨床治療的重點。免疫療法有望成為預防和治療該類感染性疾病的最有效方法之一[1]。在Hp的免疫防治研究方麵,應用細菌的超聲粉碎抗原、純化尿素酶(Ure)、細胞空泡毒素和熱休克蛋白(Hsp)等作為抗原免疫動物均取得了較好的免疫預防和治療效果[2-4]。但由於Hp屬微需氧菌,培養條件要求高,難以獲得大量天然來源的Ure及Hsp等亞單位成分,我們對Hp重要的保護性抗原hspA基因進行了克隆表達並用於臨床檢測,現將結果報告如下。
一、材料與方法
1.質粒、菌株及血清來源:質粒PinPointTMXa-3購自Promega公司,E.coli JM109及Hp菌株為本室保存菌種。血清采自西南醫院因上消化道症狀就診患者40例。其中男性20例,女性20例,年齡20~76歲,平均46歲。正常人血清采自尿素酶法陰性無消化道症狀者20名。
2.酶及試劑:EcoRV、 HindⅢ購自寶靈曼公司,T4連接酶、Taq DNA聚合酶、RNase、PCR Markers、低分子量標準蛋白Markers購自華美生物工程公司。辣根過氧化物標記的鏈黴親和素(S-A/HRP)購自中山生物工程公司,SoftLinkTM親和樹脂購自Promega公司,其他常規試劑為分析純。
3.質粒的製備:DNA片段分離回收,DNA連接,細菌轉化,重組菌的培養條件和誘導及表達產物的SDS-PAGE、免疫印跡分析均按常規方法進行。
引物1:5′-CCCAAGCTTATGAAGTTTCAACC-3′
HindⅢ
引物2:5′-GACGATATCTAAATGACAGCGAGCTTC-3′
EcoRⅤ
4.親和層析純化:表達產物采用PinPointTMXa純化係統純化。將1 000 ml LB培養基製備的菌體離心處理後溶於20 ml pH 7.0的PBS洗中,超聲粉碎,8 000 g離心15 min緩緩加樣(<1 ml/min),至少用5×柱床體積的PBS液洗柱,用含5 mmol/L生物素的100 mmol/L PBS緩衝液洗脫。收集,透析以除去遊離生物素。
5.酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定表達產物的活性:以抗血清為一抗,加酶標單抗人抗體稀釋液為二抗,上樣及免疫顯色均按常規方法進行。
二、結果
1.構建HspA的基因片段與載體PinPointTMXa-3融合表達質粒經酶切分析及序列測定為重組質粒。
2.HspA在JM109中的表達及純化:重組菌經IPTG誘導後,用PinPointTMXa純化係統親和層析柱分離純化得到可溶性表達的HSPA融合蛋白,純度在90%以上。
3.應用純化的融合蛋白HspA,采用ELISA方法檢測臨床標本40例,8例血清與重組蛋白HspA反應陽性,陽性率20%,20例正常人血清與之無交叉反應。
三、討論
熱休克蛋白是幽門螺杆菌共有的抗原成分。HspA誘發機體產生保護性免疫反應已得到證實[5,6]。近年來對HspA抗原成分的研究受到重視。在本研究中,采用基因工程的方法獲得了表達HspA特導性抗原的重組菌株,又經親和層析純化獲得足量的HspA純品,用ELISA方法檢測的8例陽性標本均為胃潰瘍或十二指腸潰瘍明確病史十年以上,證實了Perez等HspA血清抗體陽性是Hp長期感染的結論[7]。同時檢測非Hp感染患者20例,均為陰性,無非特異性交叉反應。此方法操作簡便,一次可完成多份標本的檢測,具有無創傷和重複性好的優點,可用作Hp感染的初篩。
基金項目:國家“九五”重點科技攻關課題(96-901-01-54);全軍“九五”醫藥衛生科研基金課題(98D044)
作者:郭學青 鄒全明 中華醫學檢驗雜誌 2000年第6期第23卷
參考文獻
1,Chen MH.Chen BL.The prospect and actuality on Helicobacter pylori vaccine. Weichangbingxue,1996,2:32.
2,Michetti P, Crothesy-T heulaz I, Davin C, et al.Immunization of BALB/c mice against Helicobacter felis infection with H. elicobacter pylori urease. Gastroenterology, 1994, 107:1002-1011.
3,Manetti R, Massari P, Burroni D, et al. Helicobacter pylori cytotoxin :importance of native conformation for induction of neutralizing antibodies.Infect Immun, 1995, 11:4476-4480.
4,Ferrero RL, Thiberge JM, Kansau I, et al. The Groes homolog of Helicobacter pylori confers protective immunity against mucosal infection in mice.Proc Natl Acad Sci USA,1995,92:6499-6503.
5,Maarta M, Beatrice A, Daniela B, et al. Development of a mouse model of Helicobacter pylori ilnfection that mimics human disease. Sciense,1995,23:267.
6,Ferrero RL.Thiberge I.Kansay I.Immunisation with helicobacter pylori heat-shock protein A(HspA) and urease B (UreB) affords total protection against H felis infection of mice. Gut, 1995, 37 Suppl,1 :51.
7,Perez GI, Thiberge JM, Labigne A, et al. Relationship of immune response to Heat-shock protein A and characteriatics of Helicobacter pylori infected patients. J Infect Dis, 1996,174:1.
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