摘 要
目的 幽門螺杆菌(Hp)在體外很易發生球形變，目前一般認為是不能培養的退化狀態. 而對Hp在環境中生存方式和如何感染大量人群仍不清楚，為此本研究對Hp的形態變化尤其是球形變的返祖進行了研究.
方法 本研究通過對18株Hp在不同條件下的培養，觀察其生存及形態變化，並在加有雞蛋和小牛血清的空彎培養基上及加有血清有布氏肉湯培養基中是進行培養和返祖，觀察其變異規律.
結果 Hp可在室溫液體中繁殖，18株中觀察到3株球形體Hp在室溫下的返祖，除常見球形變外的Hp杆狀彎曲、長杆狀、短杆狀、長絲體、巨球體、絲球體、原生質體及細小“S”和弧形變異. 並根據Hp形態變化的順序及表型，初步發現Hp由典型“S”或多螺旋形態變為杆狀彎曲、長杆狀、短杆狀、然後變為球形、長絲體、巨球體、絲球體、原生質體的規律. 部分變異體在一定條件下可返祖.
結論 Hp易發生多形變化，有一定規律. 可在室溫下生長繁殖，球形體可在Hp雞蛋培養基上或室溫液體培養基中返祖. 提示Hp的球形變在其感染和治療後的複發中起重要作用.
Transformation and reversion of
Helicobacter pylori in vitro
XU Zhi-Min, ZHOU Dian-Yuan, PAN Ling-Jia and SONG Shan
Chinese PLA Institute for Digestive Diseases, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China
Subject headings Helicobacter pylori; Helicobacter pylori infection; culture media
Abstract
AIM Helicobacter pylori (Hp) is subject to transforming from bacterial to coccoid in vitro. The coccoid form of Hp is considered uncultivable and as degenerative status. How does Hp survive in environment and infect so many people are still unknown.
METHODS Eighteen Hp strains were cultivated under different conditions to show its transformations. Campylobacter jejuni selected media supplied with egg and calf serum (EHP media) and Brucella broth supplemented with calf serum were used to cultivate Hp for reverting coccoid to bacterial under different conditions.
RESULTS Hp can grow in liquid media in room temperature, and 3 out of 18 strains of coccoid Hp reverted to bacterial. Besides coccoid of Hp transformations, curve-bacilliform, long-bacilliform, short bacilliform, long threadlike, giant coccoid, glomerule, trophoplast, and very small “s” or “c” shaped Hp were found. According to the change sequence and phenotype, the variant rules were revealed that typical S-shaped or multi-spiral Hp can change to curve or long or short bacilliform, which may then change to coccoid, long threadlike, giant coccoid, trophoplast or glomerule, some of the variants could revert under certain conditions.
CONCLUSION Hp can easily transform from one phenotype to another as the variant rule, and can live in room temperature and propagate. Coccoid form of Hp can revert to typical form on EHP media or in liquid in room temperature, suggesting that coccoid Hp may play an important role in Hp infection and relapse.
0 引言
幽門螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)在體外很易發生球形變，在體內抗生素作用下也可發生球形變［1］. 國內曾報道Hp在一定誘導條件下尚可發生L型變異［2］. 由於人群Hp感染率很高及清除Hp治療後易複發，Hp的形態變化與其傳染或複發是否有關是一個值得研究的問題. 我們通過對Hp在體外培養或生存條件下的形態變化規律進行研究，以揭示Hp可能的傳染和複發的規律.
1 材料和方法
1.1 材料 菌株：Hp臨床分離株17株、Hp標準株NCTC11637(國外引進，本室保存). 培養基：①固體培養基：普通Hp培養基(空腸彎曲菌培養基瓊脂基礎+50mL/L凍融羊血)和Hp雞蛋培養基(添加50mL/L雞蛋清、1.25g/L蛋黃、30mL/L小牛血清和10mL/L羊血). ②Hp液體培養基(布氏肉湯+100mL/L小牛血清)在1000mL抽氣瓶、100mL輸液瓶和6mL玻璃瓶中進行，培養液量分別為50mL～100mL，10mL～20mL和1mL～2mL. ③Hp選擇性抗生素(Skirrow或Dent選擇性抗生素).
Hp特異引物：16S rRNA基因(5’-GCGCAATCAGCGTCAGGTAATG-3’，5’-GCTAAGAGATCAGCCTATGTCC-3’)，ureA(5’-GCCAATGGTAAATTAGTT-3’，5’-CTCCTTAATTGTTTTTAC-3’)，cam(5’-CATCTTGTTAGAGGGATTGG-3’，5’-TAACAAAAAGATAATGGCGC-3’)，PCR試劑，DNA-溫度循環儀(Perkin Elmer-480)；原位PCR儀. 抗Hp抗體(日產)，免疫組化試劑及其他常規試劑. 光鏡(Olympus)，掃描電鏡(Hitachi, S-450)及透射電鏡(JEOL，JTM-1200EX). 其他常規儀器.
1.2 方法 Hp分離：采用固體培養分離培養，-70℃保存複蘇. Hp的形態誘變：對18株Hp進行固體和液體培養(固體培養：37℃微氧環境培養；液體培養：微氧環境或非換氣條件，振蕩或非振蕩，37℃，室溫下培養或4℃保菌). 在不同時間(固體培養2d～7d，液體培養6h～30d)觀察不同條件下其球形變及其他形態變異及可能的返祖. 部分經抗生素誘變. Hp形態觀察：常規光鏡暗視野下觀察活菌的形態、動力，Gram染色油鏡觀察及掃描電鏡和透射電鏡觀察Hp的形態及超微結構. Hp胞壁染色及透射電鏡觀察Hp細胞壁的完整性. 觀察不同時間和不同條件下Hp的形態變化及順序，探討其規律. Hp變異體的鑒定：采用免疫組化及PCR和原位PCR鑒定.
2 結果
2.1 球形變 Hp生長緩慢，在37℃微氧環境下固體培養通常需要2d～5d. 液體培養時在微氧環境或非換氣條件下，振蕩或非振蕩培養，37℃或室溫下培養均可見Hp增殖. 在培養條件下Hp呈多形性，球形體是Hp最常見的變異形態，在普通Hp培養基上37℃微氧條件下，通常於3d開始出現球形變，5d較多或幾乎均為球形體. 在Hp雞蛋培養基上37℃微氧條件下，一般於2d開始出現球形變，3d較多或大部分球形變，5d幾乎均球形變. 在液體培養條件下情況較複雜：Hp增殖較差時較早出現形態不典型或球形變，可數天無明顯變化；Hp增殖良好時，一般1d～3d可見球形變(主要與Hp增殖密度和增殖力有關)，大於5d或培養液明顯混濁時球形變明顯增加；在不同條件下(微氧環境或非換氣條件，振蕩或非振蕩，37℃，室溫下培養或4℃保菌)其球形變時間、Hp動力有明顯差異.
2.2 球形變的返祖 ①在固體培養基上的返祖：將絕大部分已發生球形變的Hp傳種於固體和液體培養基中，僅在Hp雞蛋培養基上易於傳代. 我們將1例在100mL液體培養基中培養至21d的Hp(絕大多數已呈氣球樣變，暗視野下難以觀察到典型Hp)接種於多種培養基上，僅在Hp雞蛋培養基上有較多典型Hp生長，並動力較好. ②在液體培養基中室溫下的返祖：將液體培養主要呈球形Hp 6例留1/2培養液置於4℃～8℃冰箱中保存2d～6d，在3d後移至室溫下複蘇時有2株出現球形Hp明顯減少而典型Hp增多(典型Hp具有較好動力)；另1/2含Hp球形體培養液在37℃下繼續培養見Hp球形體增多而難以見到典型Hp. 不同時間將典型Hp(固體及液體培養)置4℃～8℃冰箱中保存2d～7d，於2d～3d可繼續傳代. 1株(分離自球潰)於振蕩培養20d的球形Hp(暗視野觀察見絕大部分的均為球形，可見個別近典型Hp)移至室溫下，觀察後未再抽氣(有氧環境)行靜止培養4d，培養液混濁更加明顯，見大多數為典型Hp而球形Hp明顯減少. 其他菌株繼續振蕩培養觀察21d～1mo仍以球形Hp為主並發生氣球樣變.
2.3 長絲體和絲球體變異及返祖 在同樣條件下，Hp發生球形變後一般不易出現其他形態變異. 反複傳代中發現1例在Hp雞蛋培養基上培養至d5時出現較多的長絲體變異：菌體呈長絲狀，長度約為典型Hp的3～10倍，有的彎曲纏繞，在革蘭染色中粗細不均. 長絲體菌落形態與典型Hp菌落無異；唯較大菌落者長絲體多見. 後傳種於新鮮Hp培養基和Hp雞蛋培養基均能返祖. 再次球形變時間推遲. 另發現1例在Hp雞蛋培養基上出現絲球體變異：菌體如長絲狀，菌體中央出現一個大小不一的球形，Gram(-)，免疫組化(+)，未能返祖.
胞壁染色示Hp球形變者除少數有缺壁外胞壁大多完整，而長絲體多缺壁，長絲體中的巨球體也缺壁，尚未形成巨球體的小球體胞壁多完整.
2.4 其他變異體 在Hp出現明顯形態變異過程中常出現一些中間變異，主要表現為：杆狀彎曲、不規則杆狀彎曲、細長杆狀、短杆狀、細小S形、弧形和細小顆粒樣. 前四者傳代時很易回複，而繼續培養時形態更加不典型. 球形變Hp久置室溫下易發生細小S形、弧形和細小顆粒樣變形，但尿素酶試驗(-)，電鏡示細小顆粒為原生質體.
根據Hp的多種形態變異及與時間和形態變異前後的關係，初步得出其形態變化規律：典型Hp(S形或多螺旋)→杆狀(短杆或長杆變異)或者球形變；杆狀變→長絲體，而球形體→巨球體、絲球體、原生質體；部分變異體在一定條件下可以返祖成典型的S型Hp.
3 討論
Hp是一種形態易變的細菌，其主要的變異體是球形體，在過期培養、抗生素作用及體外不適環境下均易發生. 國外對此研究較多. 國內賈繼輝尚對Hp的L型進行了研究，發現Hp在羧苄青黴素誘導下可發生長絲體和巨球體變異，且初代不穩定［2］. 一般認為，Hp的球形變是其一種退行變形態，具有生存能力，但不能繁殖，多數是一種接近死亡的形態，在體內外不能回複成典型Hp. 我們在一定實驗條件下(接種於Hp雞蛋培養基37℃微氧或液體培養基非換氣室溫下培養)觀察到Hp的球形體減少而典型Hp明顯培養，可在普通Hp平板上傳代，提示Hp球形體在體外(接近環境條件)下的存在一定的返祖能力. 提示環境中的異形Hp或治療後可能的變態Hp的回複可能是Hp感染或複發的機製.
3.1 Hp球形體的活力 目前對Hp球形體的活力存在兩種觀點. 一種認為Hp球形體是退變的形態，沒有意義；另一種觀察認為Hp的球形體有一定的活力，在Hp感染治療後的複發中起一定的作用. Nilius et al［3］對多種抗Hp藥物誘導及培養24d老化的Hp球形體行免疫印跡檢查發現多條反應帶缺失或減弱，結合超微結構認識Hp的球形體是嚴重退行變的形態. Narikawa et al［4］通過比較抗Hp藥物誘導3d～12d的Hp球形體與典型Hp的DNA，RNA及逆轉錄PCR發現3d後Hp球形體的DNA及RNA僅為典型Hp的1/6.8和1/8.1倍；7d後是典型Hp的1/11.5和1/14.7. 球形體DNA的瓊脂糖電泳示彌散而非清晰條帶. 尿素酶A的mRNA RT-PCR均為陰性，提示Hp球形變基因組DNA損害且未能修複，是一個退化過程. 而Kusters et al［5］根據Hp尚有半數仍為杆狀卻失去可培養能力及Hp球形體RNA和DNA量的減少認為Hp的球形體是死亡的細菌. 我們采用改良的Hp雞蛋培養基對即使隻有偶見接近典型形態的Hp(液體振蕩培養21d)仍可繼續傳代，而在一般常用的Hp培養基上通常不能培養，這種培養的差異. 不能用Hp是否能培養確定Hp變異體是否存活的依據，因為目前對Hp的最佳培養條件及不同變異體的返祖條件的認識有很大的差距. 隨著Hp球形變時間的延長，其DNA和RNA水平呈進行性下降，但不能因此否認早期球形變Hp便是死亡的Hp，而此時Hp球形體難以純化，為進一步的研究帶來很大的困難. 對Hp球形體的超微結構研究表明，其胞膜完整，部分甚至增厚、胞質均勻與典型Hp無異，部分尚有鞭毛，對上皮細胞的粘附無明顯影響，不能排除其早期的Hp球形體仍存活且可返祖. Bode et al［6］對多種抗Hp藥物誘導的球形體ATP，RNA和DNA研究表明，其有限的代謝水平可維持RNA，DNA及細胞壁至少3mo，認為用標準的實驗室方式不能使Hp球形體增殖或返祖.
3.2 Hp球形體的返祖 目前國內外均未對Hp的球形體在體外返祖成功，且認為一般是不能培養. Cellini et al［7］通過將培養20d的Hp接種於Balb/c小鼠，2wk後檢出Hp，推測Hp球形體在小鼠體內返祖. 但Eaton et al［8］同時將典型Hp和Hp球形體接種於悉生小豬，僅典型Hp均定植成功. Chan et al［1］通過HE染色在人類胃內發現Hp球形體，與典型Hp同時檢出達82.8%(53/64). 而Lee et al［9］自人胃粘膜分離出的是一種具有潛在致病性的球形體，Gram染色陽性及尿素酶陽性，與Hp的球形體不同. 我們的實驗證明，Hp可以在接近環境的液體條件下(室溫、非換氣、靜止培養)生存和繁殖. Hp是微需氧細菌，在靜止條件下在遠離液麵的液體中可以達到微氧條件，尤其在自然條件下合並的需氧菌的生長，消耗氧氣更易達到微氧條件. 我們在持續數月的液體培養中捕捉3株Hp球形體在室溫下返祖. 由於對返祖規律尚未完全認識，重複較為困難. Hp的球形變返祖提示其Hp的感染 和治療後的複發中起重要作用，仍需要作進一步的研究，以揭示Hp的變異和返祖規律.
作者：徐智民 周殿元 潘令嘉 宋 姍
單位：第一軍醫大學南方醫院全軍消化內科研究所 廣東省廣州市 510515
4 參考文獻
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