肺炎克雷伯杆菌對β-內酰胺類抗生素的耐藥機製

肺炎克雷伯菌為G - 球杆形，無鞭毛，有較厚的莢膜，多數菌株有菌毛，營養要求不高，在普通培養基上生長的菌落大，呈黏液狀，以接種環挑之易拉成絲為特征有助於鑒別［1］ 。是人類呼吸道和腸道的常見病，也是重要的條件致病菌，可引起呼吸道、泌尿道、腸道感染、血液、手術切口、皮膚軟組織等多個部位感染，近年來肺炎克雷伯菌感染有明顯增加的趨勢，並且成為革蘭陰性杆菌和醫院內感染的主要致病菌之一。由於各種抗菌藥物的廣泛使用導致肺炎克雷伯菌對以β-內酰胺類抗生素為主的多種抗菌藥物產生耐藥性，常可以引起各種難治性感染。

   

　　細菌對β-內酰胺類抗生素耐藥機製包括:①質粒介導或染色體突變產生β-內酰胺酶破壞β-內酰胺環，滅活抗生素。②改變細菌外膜蛋白，降低抗生素的通透性，阻礙其進入內膜靶位;③抗生素靶位的修飾，或是改變青黴素結合蛋白（PBPs）數量，或是降低藥物與PBPs的親和力，肺炎克雷伯菌的PBPs與大腸杆菌的PBPs相似，但目前尚未在臨床菌株中發現由PBPs介導的這類細菌耐藥性。肺炎克雷伯菌對β-內酰胺類抗生素的耐藥機製主要是通過產生β-內酰胺酶破壞抗生素，降低細胞膜對抗生素的通透性及形成生物膜的群體作用。

 

　　1 產酶

   

　　1.1 β-內酰胺酶

   

　　1.1.1 廣譜β-內酰胺酶 革蘭陰性杆菌產生的β-內酰胺酶是細菌耐藥的主要機製之一。廣譜β-內酰胺酶屬功能分類法2b組，分子分類法的A類，包括SHV-1、TEM-1及TEM-2等類型肺炎克雷伯菌主要是產SHV-1型酶。肺炎克雷伯菌可以產生幾乎所有類型的β-內酰胺酶，根據其決定基因的數量、編碼、傳導和表達方式，將β-內酰胺酶主要劃分為染色體介導的誘導酶和質粒編碼的其他類型的β-內酰胺酶，其中的後者在耐藥性表達方麵尤為重要。隨著頭孢菌素類抗生素的廣泛應用，臨床分離的肺炎克雷伯菌產廣譜β-內酰胺酶越來越普遍，而且漸漸衍生出耐藥性很強的超廣譜β-內酰胺酶。

   

　　1.1.2 超廣譜β-內酰胺酶（ESBLs） ESBLs是由革蘭陰性杆菌產生的最重要一類β-內酰胺酶，屬功能分類的2be組，分子分類的A類，其分子基礎常是質粒介導的β-內酰胺酶基因的點突變導致的相應酶上一個或多個氨基酶改變，是最新一代的抗生素選擇壓力的結果。1983年最先在德國發現一株肺炎克雷伯菌臨床分離株可以產生一種質粒介導的β-內酰胺酶 ［2］ ，氨基酸序列分析顯示是由於SHV-1在238位點發生甘氨酸到絲氨酸的突變所致，這種酶稱為SHV-2，隨後，在臨床分離了肺炎克雷伯菌中發現了SHV-5、SHV-12、SHV-13、SHV-14、SHV-16、SHV-18、SHV25-27等SHV型ESBLS ［3］ 和TEM-47、TEM-48、TEM-49等TEM型的ESBLS ［4］ ，以及CTX-M-12、CTX-M-14、CTX-M-17、PER-2、VEB-1等非SHV、TEM型ESBLS ［5～6］ 。這些突變酶的水解底物譜較廣，能有效水解青黴素類，一至三代頭孢菌素類和氨曲南，一部分甚至水解第四代頭孢菌素類。碳青酶烯類和頭黴素類。

    

　　肺炎克雷伯菌產ESBLs率較高，國外報道［7］ 產酶率約10%～40%。最近黎巴嫩一家大型醫院臨床分離的1248株肺炎克雷伯菌中20%產ESBLS。以ICU分離出的菌株產ESBLS率最高，為38.4%。國內報道產ESBLS率亦在20%～50%之間，且近年報道產酶率多在40%以上，華山醫院報道 ［8］ ICU等科室分離出的肺炎克雷伯菌產ESBLS率高達51%。國內研究報道肺炎克雷伯菌臨床分離菌株中ESBLS以CTX-M基因型為主，其主要水解底物為頭孢塞肟，但對頭孢他啶水解率很低。

   

　　1.1.3 頭孢菌素酶（AmpC） sAmpC酶是革蘭陰性杆菌產生的又一類重要的β-內酰胺酶，屬功能分類法的Ⅰ組，分子分類法的C類，編碼AmpC酶的基因常發現在腸杆菌科，包括腸杆菌屬、誌賀菌屬、普羅威登斯菌屬和大腸埃希菌屬的染色體上。

   

　　1988年美國Rhode島院內感染流行，從這些院內患者身上分離出一株肺炎克雷伯菌，此菌株產生的β-內酰胺酶是有Bush I類酶的生化特性，其基因與陰溝杆菌的染色體AmpC基因是有90%同源性，對第二代頭孢菌素、頭酶素及酶抑製劑複合物均耐藥，且這種耐藥性可傳遞，後來被確認為質粒介導的AmpC酶，命名為MIR-1 ［9］。肺炎克雷伯菌產生的AmpC酶有ACT-1、MOX-1、CMY-2、FOX-1、ACC-1、MOX-2、DHA-1等［10～12］ 。Ampc酶在臨床上是有重要意義，因為它們對臨床上廣譜的β-內酰胺類抗生素包括三代頭孢菌素、單環酰胺類、頭酶素類等β-內酰胺類抗生素氨曲南等具有耐藥性，且不受臨床常用的β-內酰胺酶抑製劑克拉維酸、舒巴坦、三唑巴坦抑製，但對四代頭孢和碳青黴烯敏感。Cao ［13］ 等研究證明，由質粒介導的Ampcβ-內酰胺酶如ACT、或CMY-4結合外膜蛋白缺失，可產生對碳青酶烯類如亞胺培南耐藥。Yan ［14］ 等新發現的CMY-8，其核苷酸和氨基酸序列分析顯示與MOX-1與CMY-1具有同源性，它們都對頭孢塞肟和頭孢西丁呈現高度耐藥性。

 

　　1.1.4 耐酶抑製劑β-內酰胺酶 耐酶抑製劑β-內酰胺酶於1989年在大腸埃希菌中首先發現，屬功能分類法的2br類，分子分類法的A類，此類酶除SHV-10及OHIO-1以外均為TEM型β-內酰胺酶。1995年法國Lemozy等 ［15］首次發現兩株肺炎克雷伯菌對阿莫西林/克拉維酸耐藥。而對頭孢噻吩完全敏感，通過分子生物學鑒定為產IRT-1，IRT-2型β-內酰胺酶菌株，隨後Girlich等 ［16］ 報道法國一家醫院老年病房192位患者身上可分離出對阿莫西林與克拉維酸的複合製劑耐藥的肺炎克雷伯菌，其中11株分子生物學鑒定為產IRT-2型β-內酰胺酶，其編碼基因位於質粒上，提示產耐酶抑製劑β-內酰胺酶的肺炎克雷菌可能導致醫院內感染的爆發。一般而言，產耐酶抑製劑β-內酰胺酶可導致肺炎克雷伯菌對青黴素類、以及青黴素類與β-內酰胺酶抑製劑克拉維酸、舒巴坦的複合製劑的耐藥性，但對頭孢菌素類及青黴素類與三唑巴坦的複合製劑敏感，此類酶不被克拉維酸和舒巴坦所抑製，卻可以被三唑巴坦抑製。目前國內外肺炎克雷伯菌產生此類酶的報道不多。

   

　　1.1.5 碳青黴烯酶 碳青黴烯類抗生素是具有廣譜抗菌活性的β-內酰胺酶類抗生素，具有抗頭孢菌素誘導酶，抗TEM和SHV型超廣譜酶等優點。是治療效果比較理想的抗感染藥。但由於廣泛應用，目前已出現了能水解碳青黴烯類的β-內酰胺酶。碳青黴烯酶分二組:一組為非金屬碳青黴烯酶。2001年Yijit ［17］在肺炎克雷伯菌中發現屬於Bush分類法的功能分類2f群，分子分類A群，但與Sme-1僅有45%同源性的KPC-1對碳青黴烯類，頭孢菌素類呈現高度耐藥;而大多數碳青黴烯酶屬另一組即金屬酶，屬功能分類法的3組，分子分類法的B組。1991年在日本發現IMP-1後，全球有陸續報道，主要分布在銅綠假單胞菌和粘質沙雷菌。到目前為止，碳青黴烯酶在肺炎克雷伯菌中發現不多。近來Poirel報道 ［18］ 一株肺炎克雷伯菌產生染色體編碼的SHV-38型β-內酰胺酶可水解亞胺培南，SHV-38和SHV-1氨基酸序列146位纈氨酸被丙氨酸所取代而成的衍生物，這是第一株SHV型的β-內酰胺酶可水解碳青黴烯類的報道。產碳青黴烯酶可導致肺炎克雷菌對碳青黴烯類、青黴素類、廣譜頭孢菌素及單環類等抗生素的耐藥性，由於目前產碳青黴烯酶臨床菌株相對少見，碳青黴烯類仍可作為臨床難治性感染的有效治療選擇，但碳青黴烯類的廣泛使用有可能導致碳青黴烯酶的產生、流行，而其中的金屬酶因不被臨床常用酶抑製劑所抑製，造成了威脅將很大，應引起足夠重視。

   

　　2 外膜孔蛋白缺失

   

　　雖然大多數情況下，外膜孔蛋白缺失不是主要的耐藥機理，但它可降低細菌對抗生素的敏感性，在其它的耐藥機理存在的情況下，可明顯提高耐藥程度。多數β-內酰胺類抗生素外膜孔蛋白通透率較低，一旦外膜孔蛋白缺失或減少就會造成抗生素進入細菌細胞內的量大減，引起耐藥而氨基糖甙等尚有其它通道進入胞內，故受影響不大，所以外膜孔蛋白缺失造成的耐藥性主要與β-內酰胺類抗生素有關。孔蛋白缺失與抗生素的耐藥性關係在革蘭陰性杆菌中已有報道，然而導致孔蛋白缺失和隨後產生抗生素耐藥的機理目前尚未完全清楚。插入序列（IS）與某些抗生素的耐藥性有關。通過產生新的耐藥 基因啟動子，但IS插入孔蛋白基因引起抗生素的耐藥由Herndndez Alles等 ［19］ 首次報道。產ESBL的肺炎克雷伯菌在孔蛋白的OMPK36和OMPK35降低或缺失時，能增加對頭孢西丁和頭孢菌素類的耐藥性。OMPK36基因突變包括點突變、小片段缺失，整個基因缺失或插入。可最常見的基因突變是插入，以發現4種不同的插入序列（IS26、IS5、IS903和IS1）定位在OMPK36基因的不同位置，孔蛋白基因上IS的插入能幹擾或改變基因表達，引起的肺炎克雷伯菌的孔蛋白缺失，導致對β-內酰胺類抗生素耐藥。

   

　　目前公開報道的與肺炎克雷伯菌耐藥性有關的孔蛋白中多數抗性蛋白是孔蛋白OMPK36和OMPK35。西班牙Hernandez Alles ［15］ 報道利用插入序列幹擾肺炎克雷菌OMPK36孔蛋白合成造成外膜OMPK36孔蛋白缺失，導致肺炎克雷伯菌對頭孢西丁的耐藥增加，較好地證實了外膜孔蛋白缺失可直接導致肺炎克雷伯菌產生耐藥性。外膜孔蛋白缺失協同AmpC類β-內酰胺酶時耐藥程度較β-內酰胺酶單獨作用時更高。

 

　　3 細菌生物被膜形成

   

　　細菌在生長過程中通過鞭毛或其附著結構牢固地附著於固體表麵，進行生長、分裂和繁殖，同時其他遊走性細菌繼續附著，導致該位點的細菌生長環境極度擁擠，有毒的代謝物堆積，許多細菌得不到營養。在這種競爭壓力下，細菌啟動細胞間信號，經信號係統的調節，細菌一邊分泌胞外多糖Eps，一邊從固體表麵輕輕地移動，最終形成多細菌蘑菇樣或柱體亞單位，多個亞單位形成成熟的細菌生物被膜，生物被膜是細菌的特殊存在形式。

   

　　最近研究發現，生物被膜是肺炎克雷伯菌產生耐藥性的重要機製之一。目前認為對β-內酰胺類抗生素而言肺炎克雷伯菌生物被膜耐藥機製可能有:①在生物被膜環境中，細菌表麵改變，抗生素作用位點消失，或作用位點存在，但抗生素無法作用。②生物被膜中細菌分泌的碳氫化合物被膜和抗生素降解酶如β-內酰胺酶合成，可阻止抗生素穿入。③生物被膜中的細菌由於營養限製導致低生長率，並以靜止狀態長期存在，這使得僅殺傷分裂狀態細菌的抗生素對其難以發揮作用。An-derl等 ［20］ 報道用10倍MIC濃度的氨卞西林處理浮遊生長及生物被膜狀態的肺炎克雷伯菌，因為生物被膜阻止了氨卞西林滲入而導致生物被膜狀態的肺炎克雷伯菌產生耐藥性。即細菌生物被膜狀態比浮遊狀態對抗菌藥物的耐藥性明顯增升，呈現細菌群體耐藥形成。另有報道生物被膜還有可能因為接觸抗菌藥濃度低，較浮遊生長菌有更多機會被誘導產生β-內酰胺酶而引起耐藥等等目前尚無定論，有待進一步的研究。

 

　　4 主動外排的機製

   

　　主動外排係統與細菌形成多重耐藥性有關。由於這種係統的轉運底物大多非常廣泛，而且同一株細菌可存在多種主動外排係統，因此可導致細菌產生對各種結構完全不同的抗菌藥物的耐藥即多重耐藥。

   

　　肺炎克雷伯菌對β-內酰胺類抗生素的耐藥往往不是由單一因素造成的。細胞胞膜通透性降低和β-內酰胺酶產生之間發生協同作用;細菌群體的生物膜耐藥與多種耐藥機製有關;尤其是產ESBL耐藥基因質粒的廣泛傳播加速了多種耐藥的產生。故加強肺炎克雷伯菌分離株的耐藥監測，分析總結其耐藥規律和特點，有助於指導臨床合理應用抗生素。為設計針對耐藥機製並具有高濃度抗藥活性的新一代β-內酰胺類抗生素提供依據。

 

　　參考文獻:

    

　　［1］周正任.醫學微生物學［M］.第2版.北京:人民衛生出版社，2003，181～182.   

　　［2］Kliebe C，Nies B A，Meyer J F.et al Evolution of plasmid-coded resis-tance to broad-spectrum cephalosporins［J］.Antimicrob Agents Chemoth-er，1985，28（2）:302～303   

　　［3］Corkill J E，Cuevas L E，Gurgel KQ，et al.SHV-27.a novel cefotaxime-hydrolysing beta-lactamase.Identified in Klebsiella pneumoniae isolates from a Brazilian hospital ［J］.Antimicrob Chemother，2002，47（4）:463～464   

　　［4］Gniadkowski M，Schneider I，Jungwirth R，et al.Ceftazidime-resistant Enterobacteriaceae isolates from three Polish hospitals:idetification of three novel TEM and SHV-5type extended-spectrum beta-lactamases.［J］.Antimicrob Agent Chemother，1998，42（3）:514～515.   

　　［5］Kariuki S，Corkill J E，Revath G，et al.Molecular charaterization of a novel plasmid-encoded cefotaximase（CTX-M12）found in clinical Kleb-siella pneumoniae isolates from Kenya［J］.Antimicrob Agent Chemother，2001，45（7）:2141～2143.    

　　［6］Poirel L，Naas T，Cuibert M，et al.Molecular and biochemical of VEB-1.a novel class A extended-spectrum beta-lactamase encoded by an Es-cherichia coli integron gene ［J］.Antimicrob Agent Chemother，1999，43（3）:573～574.   

　　［7］Rupp M，E Fey P D.Extended spectrum beta-lactamase（ESBL）produc-ing Enterobacteriaceae:considerations for diagnosis prevention and drug treatment［J］.drugs，2003，63（4）:353～356.   

　　［8］Xiong Z，Zhu D，Zhang Y，et al.Extended-spectrum beta-lactamase in Klebsiella pneumonia and Escherichia coli isolates［J］.Clin med J，2002，82（21）:1476～1478.   

　　［9］Papanicolaou G A，Medeiros A A，Jacoby G A，et al.Novel plasmid-mediated beta-lactamase MIR-1）conferring resistance to oxyimino-and alpha-methoxy beta-lactamase in clinical isolates of Klebsiella pneumoni-ae［J］.Antimicrob Agents Chemother，1990，34（11）:2200～2202.   

　　［10］Jing-Jou Yan，Wen-Chien Ko，Yu-Chih Jung，et al.Emergence of Klebsiella pneumoniae isolates producing inducible DHA-1?-actamase in a University Hospital in Taiwan［J］.Clin Microbio，2002，40（9）:3121 ～3126.  

　　［11］ Anne Marie Queenan，Stephen Jenkins，Karen Bush.Cloning and Bio-chemical characterization of FOX-5，an AmpC type plasmid-encodedβ-lactamase from a NewYork City Klebsiella pneumoniae clinical isolate［J］.Antimicrob Agent Chemother，2001，45（11）:3189～3194.   

　　［12］Philippon A，Arlet G，Jacoby G A，et al.Plasmid-determined AmpC-type beta-lactamases［J］.Antimicrob Agents Chemother，2002，46（1）:1～3   

　　［13］Cao V T，Alert G，Ericsson B M，et al.Emergence of imipenem resis-tance in Klebsiella pneumoniae owing to combination of plasimid-mediated CMY-4and Permeability alteration［J］.Antimicrob Chemother，2000，46（6）:895～900.   

　　［14］Jing-Jou Yan，Shiou-Mei Wu，Shu-Huei Tsai，et al.Prevalence of SHV-12among clinical isolates of Klebsiella pneumoniae producing ex-tended-spectrumβ-lactamase and identification of a novel AmpC enzyme（CMY-8）in southern Taiwan［J］.Antimicrob Agents Chemother，2000，44（16）:1438～1442   

　　［15］Lemozy J，Sirot D，Chanal C，et al.First characterization of inhibitor-resistant TEM（IRT）beta-lactamases in Klebsiella pneumoniae strains［J］.AntimicrobAgents Chemother，1995，39（11）:2580～2582.   

　　［16］Girlich D，Karim A Poirel.Molecular epidemiology of an outbreak due to IRT-2beta-lactamase-producing strains of Klebsiella pneumoniae in a geriatric department ［J］.Antimicrob Chemother，2000，45（4）:467～468.   

　　［17］Yijit H，Queenan A M，Anderson G J，et al.Novel carbapenem-hy-drolyzing beta-lactamase，KPC-1，from a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumoniae［J］.Antimicrob Agents Chemother，2001，45940:1151～1161.   

　　［18］Poirel L Heritier，Podglajen I.Emergence in Klebsiella pneumoniae of a chromosome-encoded SHV beta-lactamase that compromises the efficacy of imipenem［J］.Antimicrob Agents Chemother，2003，47（2）:755～757.

　　［19］Hernandez-Alles S，Benedi V J，Martinez-Martinez L，et al.Devel-opment of resistance during antimicrobial therapy caused by insertion se-quence interruption of porin genes ［J］.Antimicrob Agents Chemother，1999，43（4）:937～939.   

　　［20］Anderl J N，FranklinM J，Stewart P S.Role of antibiotic penetration lim-itation in Klebsiella pneumoniae biofilm resistance to ampicillin and ciprofloxacin［J］.Antimicrob Agents Chemother，2000，44（7）:1818～1820.