【摘要】 目的： 對34株多重耐藥銅綠假單胞菌的藥敏結果和β內酰胺酶基因進行分析，以指導臨床合理用藥。方法：用KB法對銅綠假單胞菌進行常規藥敏試驗，選取34株多重耐藥銅綠假單胞菌，並用PCR擴增方法檢測其β內酰胺酶基因：TEM，SHV，PER，VEB。結果： 34株多重耐藥銅綠假單胞菌對12種常用抗生素的耐藥率為20.5%～100%，PCR檢測出TEM為44.1%，SHV為11.8%，VEB為5.9%，PER為0%。結論： 我院多重耐藥銅綠假單胞菌攜帶的β內酰胺酶基因以TEM為主。
【關鍵詞】 銅綠假單胞菌； β內酰胺酶； 多重耐藥
Analysis on drug resistance pattern and genes of βlactamase
of 34 strains multidrugresistant Pseudomonas aeruginosa
ZHANG Hongmei, YIN Qing, CHENG Jing
(1.Department of Clinical Laboratory, Jiangning People′s Hospital, Nanjing Jiangsu 211100; 2.Department of Clinical Laboratory, the Affiliated Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang Jiangsu 212001; 3.School of Medical Science and Laboratory Medicine, Jiangsu University, Zhenjiang Jiangsu 212013,China)
［Abstract］Objective: To investigate drug resistance pattern and βlactamase genic of multidrugresistant Pseudomonas aeruginosa, so as to provide reference for reasonable selection of antimicrobials. Methods： Antimicrobial susceptibility was evaluated by disk diffusion test(KB method). The βlactamase genes: TEM, SHV, VEB, PER carried on multidrug resistant Pseudomonas aeruginosa were detected by polymerase chain reaction method(PCR). Results： The resistant rates of 34 strains multidrug Pseudomonas aeruginosa to 12 kinds of antimicrobials were from 20.5% to 100%. The positive rate of βlactamase genes TEM, SHV, VEB, PER expression was 44.1%(15/34), 11.8%(4/34), 5.9%(2/34), and 0%. Conclusion： TEM type βlactamase was the main type of Pseudomonas aeruginosa gene in our hospital.
［Key words］Pseudomonas aeruginosa; βlactamase; multidrugresistant
銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)廣泛分布於自然界，是臨床常見的條件致病菌之一，常引起肺部、泌尿係及燒傷創麵感染。近年來PA在醫院感染分離菌的分離率居首位，其耐藥率不斷升高，對多種抗生素表現出固有或獲得性耐藥，對3類或3類以上抗菌藥表現耐藥的多重耐藥(multidrug resistant，MDR)的PA不斷增加［1-5］。為了使臨床能有效控製感染，對多重耐藥菌耐藥特征的研究成了人們關注的熱點。現對我院2005年1月～2007年12月間部分多重耐藥PA的耐藥性及β內酰胺酶基因進行分析，報告如下。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 實驗菌株的收集與篩選
收集2005年1月～2007年12月我院臨床微生物科分離所得的PA，利用KB法篩選出多重耐藥的菌株。根據NCCLS2005年標準進行敏感、中敏、耐藥的判斷，3類或3類以上抗菌藥物耐藥的菌株判為多重耐藥PA。銅綠假單胞菌ATCC27853作為質控菌。共收集了34株，其中痰標本19株、尿標本2株、其他標本13株。全部細菌用法國生物梅裏埃公司API鑒定係統鑒定到種。
1.1.2 儀器和材料
溫箱、低溫冰箱、PCR擴增儀和電泳儀等。MullerHinton(MH)瓊脂為OXO IDE公司產品。
1.1.3 抗菌藥物紙片
氨曲南(ATM)、頭孢吡肟(FEP)、頭孢他啶(CAZ)、頭孢呱酮/舒巴坦(SCF)、頭孢呱酮、亞胺培南(IPM)、慶大黴素(GEN)、阿米卡星(AMK)、環丙沙星(CIP)、左氧氟沙星(LVX)、妥布黴素、磺胺甲惡唑/甲氧苄氨嘧啶(SXT)，均購自中國藥品生物製品檢定所。
1.2 方法
1.2.1 藥敏
根據NCCLS2005年標準，用KB法對銅綠假單胞菌進行常規藥敏試驗。
1.2.2 PCR檢測細菌β
內酰胺酶基因 檢測模板提取：挑純培養細菌菌落少許置入50 μl滅菌水中，置100℃水浴10 min，8 000 r/min 30 s，上清液即為DNA模板液。
根據文獻［6］和基因庫檢索，設計引物序列如下：
TEMP1：5′GAGTATTCAACATTTCCGTGTC3′，
TEMP2：5′TAATCAGTGAGGCACCTATCTC3′，擴增產物為535 bp；
SHVP1：5′TGGTTATGCGTTATATTCGCC3′，
SHVP2：5′GCTTAGCGTTGCCAGTGCT3′，擴增產物為865 bp；
PERP1：5′ATGAATGTCATTATAAAAGC3′，
PERP2：5′AATTTGGGCTTAGGGCAGAA3′，擴增產物為978 bp；
VEBP1：5′CGACTTCCATTTCCCGATGC3′，
VEBP2：5′GGACTCTGCAACAAATACGC3′，擴增產物為961 bp。引物由上海生工生物工程公司合成。
反應體係為：10×PCR緩衝液2.5 μl，dNTP2 μl，P1和P2各0.5 μl，TaqDNA聚合酶1 U，擴增模板液0.5 μl，反應體係25 μl。熱循環參數為：94℃預變性5 min，然後按94℃ 1 min→55℃ 45 s →72℃ 1 min，共35個循環；取反應管內液體5 μl 與1 μl 電泳指示劑混勻，點樣於1.2%瓊脂糖凝膠，以100 V電壓電泳30 min後，EB染色，在紫外光下觀察結果。
2 結 果
2.1 34株多重耐藥PA藥敏結果
34株多重耐藥PA對12種常用藥物的耐藥率由 20.5%至100%，具體結果見表1。表1 34株多重耐藥PA對12種常用藥物的藥敏結果（略）
2.2 PCR結果
PCR結果顯示，34株多重耐藥PA中，TEM陽性為14株，陽性率為 44.1%；SHV陽性4株，陽性率11.8％；VEB陽性2株，陽性率5.9％；PER陽性率0％。其中有3株同時攜帶SHV和TEM基因。
3 討論
多重耐藥PA感染是臨床抗感染治療的難點之一，根據對本院近年來分離到的PA藥敏結果分析，3類或3類以上抗菌藥物耐藥的PA感染已呈上升趨勢。從藥敏結果中可以看到，34株多重耐藥PA對12種臨床常用抗生素的耐藥率在20.5%～100%，對β內酰胺類、氨基糖苷類、喹諾酮類均顯示出較高的耐藥性。第三代頭孢中頭孢他啶是經典的抗PA藥物，但耐藥菌株增加迅速，本研究顯示其耐藥率達到50%，亞胺培南的耐藥率也達到了73.5%，對一些常規藥物幾乎全部耐藥，符合多重耐藥的特征。
由於PA耐藥率的不斷升高，耐藥機製複雜，以及細菌耐藥存在區域性差異，對多重耐藥菌耐藥特征的研究成了人們關注的熱點［7-9］。研究認為，PA對β內酰胺類抗生素耐藥的主要機製是產生β內酰胺酶和膜泵出係統的相互作用。β內酰胺酶是細菌產生的酶類,能夠破壞滲透入菌體內的β內酰胺類抗生素的活性。β內酰胺酶種類很多，特性各樣，按分子生物學分類，可以分為A～D 4類［10，11］，除B類為金屬酶外，其他3類的活性位點均為絲氨酸殘基。本研究利用PCR方法檢測了多重耐藥PA攜帶的A類β內酰胺酶基因：TEM，SHV，PER，VEB。TEM和PER是由質粒介導的，攜帶TEM的PA對所有的抗假單胞菌的β內酰胺類和氨基糖苷類抗生素耐藥，PER被認為是一組新的A類β內酰胺酶基因，決定可轉移的對氧亞氨基頭孢菌素、氨曲南的耐藥性。結果顯示，在34株多重耐藥PA中，TEM的檢出率達到了44.1%，但沒有檢測出PER，說明我院的多重耐藥PA攜帶的β內酰胺酶基因型以TEM為主。
SHV和VEB通常是由轉坐子或整合子介導的，常在其他腸杆菌科的細菌中檢出。本組34株多重耐藥PA中，4株攜帶SHV基因，2株攜帶VEB基因，兩者之間沒有重疊。有3株同時攜帶SHV和TEM基因，說明PA可以同時攜帶多種β內酰胺酶基因，與其他文獻報道相符［9］。
PA作為一種常見的條件致病菌，其耐藥菌株有隨著抗菌藥物使用頻率的增加而逐年增多的趨勢。PA的耐藥現狀不容樂觀，目前NCCLS/CLSI推薦的超廣譜β內酰胺酶（ESBLs）的表型初篩及確證實驗不適合檢測PA是否產ESBLs，用分子生物學的方法可以很好地分析PA中的耐藥基因型，為臨床工作者更好地控製PA感染和使用抗菌藥物提供了依據，同時，也有利於加強實驗室對院內感染菌的監控。
作者：張紅梅，陰晴，成靜 作者單位：1.南京市江寧區人民醫院檢驗科，江蘇 南京 211100； 2.江蘇大學附屬醫院檢驗科， 江蘇鎮江 212001； 3.江蘇大學基礎醫學與醫學技術學院， 江蘇鎮江 212013
【參考文獻】
［1］Gutiérrez O, Juan C, Cercenado E,et al.Molecular epidemiology and mechanisms of carbopenem resistance in Pseudomonas aeruginosa isolates from Spanish hospitals［J］.Antimicrob Agents Chemother,2007,51(12):4329-4335.
［2］Aloush V, NavonVenezia S, SeigmanIgra Y,et al. Multidrugresistant Pseudomonas aeruginosa: risk factors and clinical impact［J］.Antimicrob Agents Chemother, 2006,50(1):43-48.
［3］Reinhardt A, Khler T, Wood P,et al.Development and persistence of antimicrobial resistance in Pseudomonas aeruginosa: a longitudinal observation in mechanically ventilated patients［J］. Antimicrob Agents Chemother, 2007,51(4):1341-1350.
［4］Doi Y, Ghilardi R, Adams J,et al. High prevalence of metalloβlactamase and 16S rRNA methylase coproduction among imipenemresistant Pseudomonas aeruginosa isolates in Brazil［J］. Antimicrob Agents Chemother,2007,51(9):3388-3390.
［5］Hocquet D, Berthelot P, RousselDelvallez M,et al.Pseudomonas aeruginosa may accumulate drug resistance mechanisms without losing its ability to cause bloodstream infections［J］.Antimicrob Agents Chemother, 2007,51(10):3531-3536.
［6］糜祖煌.銅綠假單胞菌耐藥基因及其檢測［J］.現代實用醫學,2004,16(9):558-560.
［7］史偉峰,王玉月,薑慶波，等.多重耐藥性銅綠假單胞菌耐藥基因及菌株聚類分析［J］.中華醫院感染學雜誌,2007,17（9）:1057-1060.
［8］常東, 蔣偉, 魏華，等.多重耐藥銅綠假單胞菌產超廣譜β內酰胺酶基因研究［J］.中華醫院感染學雜誌,2006,16(9):961-964.
［9］侯天文,尹曉琳,王永祥,等.同時產PER1 型和TEM1型β內酰胺酶銅綠假單胞菌的檢出［J］.中國人獸共患病雜誌,2004,20(4):295-298.
［10］蔣曉飛,洪秀華,孫景勇,等.多重耐藥銅綠假單胞菌超廣譜β內酰胺酶分析［J］.中華微生物學和免疫學雜誌,2002,22(4):443-446.
［11］王家平,王蘇建,魯科峰. 239株銅綠假單胞菌的耐藥性分析［J］. 江蘇大學學報：醫學版, 2004,14(6):482-484.
上一篇：醫院內感染的病原菌及耐藥性分析
下一篇：銅綠假單胞菌肺炎167例臨床及耐藥分析
