淺談耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球菌(MRCNS)臨床鑒定方法

 葡萄球菌是臨床較常見的感染菌，隨著大量頭孢菌素尤其是第三代頭孢菌素等高效廣譜抗菌藥物的廣泛使用，耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）在全球範圍內不斷增加，耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球菌（MRCNS）作為MRS和凝固酶陰性葡萄球菌（CNS）家族中的一員，其檢出率和多重耐藥性呈逐年增高趨勢，已成為醫院感染的主要病原菌之一。MRCNS為低毒力條件致病菌，感染後症狀不典型，且呈現多重耐藥現象，給臨床診斷和治療帶來一定困難，高效的檢驗方法已是必然需要。下麵介紹實驗室常用的MRCNS的鑒定方法。

 

    1  血漿凝固酶鑒定方法

 

    1.1  血漿凝固酶玻片法、試管法［1］

 

    1.1.1  材料  菌株為實驗室保存菌株，新鮮未稀釋的兔血漿（或人血漿），生理鹽水，金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)與表皮葡萄球菌(ATCC 12228)質控菌株。

 

    1.1.2  方法  玻片法:  取未稀釋的新鮮兔血漿和生理鹽水各一滴分別滴於載玻片，取待檢菌菌落少許，分別混合，立即觀察結果，細菌聚集成團塊或無法混勻為陽性，反之陰性，用於測定凝集因子；試管法  取3支試管，各加0.5ml 1：4稀釋的新鮮兔血漿，加1～3個菌落入1試管，充分研磨均勻，2、3試管加凝固酶陽性、陰性株作對照，置37℃水浴3～4h，觀察結果，細菌是試管內血漿凝固呈膠凍狀為陽性，反之為陰性，用於測定遊離型凝固酶。

 

    1.1.3  方法評價  公認采用兔血漿較好，目前許多實驗室用病人血漿或血庫血漿來代替，因病人血漿中含有各種抗體、藥物，尤其某些病人血漿中纖維蛋白含量低下或受各種不同抗凝劑的影響甚至血漿被汙染，故一定程度上影響了結果的準確性。采用玻片法檢測凝聚因子，有10％～15％金黃色葡萄球菌呈假陰性，因此必須用試管法驗證凝聚因子試驗。

 

    1.2  血漿凝固酶陰性葡萄球菌兩步法

 

    1.2.1  材料  堿性磷酸酶試劑盒為上海長征公司產品；蕈糖、尿素、鳥氨酸脫羧酶生化試驗管與新生黴素藥敏紙片、磷黴素藥敏紙片購自美國BD公司；厭氧硫乙醇酸鹽肉湯用Brewer配方，液麵加凡士林，滅菌後換無菌橡皮塞。

 

    1.2.2  方法  按文獻［2］操作，尿素、鳥氨酸脫羧酶試驗管接種細菌後用消毒液狀石蠟覆蓋；堿性磷酸酶試驗按文獻［3］進行。兩步法鑒定與結果判定見表1。

 

    1.2.3  方法評價  對第一步鑒定出現相似結果的菌株，可根據提示選用第二步鑒定程序以省時並減少消耗。不能用本法鑒定的科恩、木糖、鬆鼠、緩慢葡萄球菌在人體內感染極為少見，必要時可用氧化酶、木糖、甘露醇等並參考有關資料進行鑒定。兩步法低耗高效，有較高的實用價值。表1  血漿凝固酶陰性葡萄球菌兩步法鑒定（略） 注：+：陽性，-：陰性，S：敏感，R：不敏感　

 

    2  甲氧西林耐藥性常用鑒定方法

 

    2.1  普通M-H平板紙片擴散法  配製0.5麥氏單位菌液接種於普通M-H平板，貼1μg/片苯唑西林藥敏紙片，35℃，24h觀察結果（CNS孵育48h），CNS≥18mm為敏感，≤17mm為耐藥［４］。

 

    2.2  含4%NaCl的M-H平板紙片擴散法  在M-H培養基中加入4%NaCl傾注平板，實驗方法和判讀標準同普通M-H平板紙片擴散法。紙片擴散法最大優點是快速、簡便、價格便宜，易被檢驗人員接受。瓊脂中如沒有NaCl成分，一些菌株的耐藥性可能得不到完全表達而導致符合率降低，為使紙片法抑菌圈明顯，提高紙片擴散法檢測MRCNS的可靠性，最好在MH瓊脂中加入40g/L NaCl。

 

    2.3  瓊脂篩選法  在含4%NaCl，6μg/ml苯唑西林M-H平板中點種0.5麥氏單位菌液，經35℃，24h（CNS 48h）孵育，隻要有一菌落生長即判斷為MRS。該法敏感度為100%，常用作校正其他方法的標準，尤其適用於檢測抑菌圈直徑處於中介度的葡萄球菌。

 

    2.4  全自動微生物分析儀法  目前有Vitek係統、ATB係統、MicroScan係統、Sensiter ARIS等。將菌液稀釋後注入藥敏板或孔內，然後通過檢測菌液濁度，熒光指示劑的熒光強度或熒光底物的水解反應來判讀結果。其檢測速度比紙片擴散法等更快捷，可以及時給出準確的報告,節約時間，但有時對生長緩慢或延遲表達耐藥性的菌株，在3～4h內難以達到檢測水平，容易漏檢或誤報［5］。

 

    3  討論

 

    目前國內外用以檢測MRCNS的方法很多，但要做到效率高、成本低、實用性強還得根據實驗室具體條件因地製宜。采用全自動微生物分析儀進行鑒定，簡便、準確、快速，適用於大型醫院及科研機構；玻片試管法、兩步法和紙片擴散法等技術，是目前可采用的較好的方法，簡捷、經濟、快速可靠，有較高的實用價值，可促進對MRCNS的研究，並適合基層醫院推廣應用。

作者：房功思， 孟德娣    作者單位：230061 安徽合肥,安徽醫學高等專科學校醫學技術係

 

【參考文獻】

  1 洪秀華.臨床微生物學和微生物檢驗實驗指導，第2版.北京：人民衛生出版社，2003，97-110.

2 婁永新，王金良.實用臨床細菌學檢驗與進展.天津：天津科技翻譯出版公司，1992，52-56.

3 李金鍾，段雄波，相青珍，等.快速微量法測定葡萄球菌堿性磷酸酶.臨床檢驗雜誌，1997，15：166-167.

4 薑緋,趙曉萌.凝固酶陰性葡萄球菌的菌種分布及流行變遷.實用醫技雜誌，2006,5(9):1-3.

5 廖舫,範昕建.耐甲氧葡萄球菌HVR基因分型及其與耐藥性關係.華西醫大學報，2001，32(2)：167-171.