新生隱球菌兩種培養方法的比較

新生隱球菌（Cryptococcus  neoformans）是一種深部致病真菌，可在土壤、鳥糞，尤其是鴿糞中大量存在。人因吸入鴿糞汙染的空氣而感染，引起隱球菌病。莢膜多糖是其重要的致病物質［1］。在微生物實驗教學過程中，常需要培養出形態典型的新生隱球菌，即圓形或卵圓形的菌體外周有一圈透明的肥厚莢膜。常規培養將菌種接種於沙保弱瓊脂培養基，室溫或37℃培養2～5天後形成白色,不規則的酵母型菌落。鏡檢可見圓形或卵圓形菌體，常觀察不到寬厚的莢膜，我們采用兩種方法培養出帶莢膜的新型隱球菌，現介紹如下。

 

　　1  實驗材料

 

　　沙保弱瓊脂高層斜麵培養基（常規方法配製）；無菌兔血清 ； "一得閣"墨汁；新生隱球菌菌種（本實驗室保存）。

 

　　2  實驗方法

 

　　2．1  傳統方法  （1）將新生隱球菌菌種接種於高層斜麵沙保弱瓊脂培養基上，電熱恒溫培養箱37℃培養約48h可形成肉眼可見的菌落。（2）取菌苔用生理鹽水稀釋成濃度為108個/ml（麥氏比濁管第7管）菌液，注意濃度不能過高，否則小鼠易迅速死亡。（3）腹腔注射（方法：先將針頭平穿入小白鼠腹腔皮下，再將針頭立起刺入腹腔內，這樣可防止拔針後菌液外溢）接種劑量分別為0.5、0.7、 1.0、1.2、 1.5ml。每種用量3隻，用不同顏色標記不同劑量。注射時小白鼠頭朝下，偏右胯，偏離生殖器。（4）觀察小白鼠（一般至少9天才會有反應，方有芽孢長出），待發病後，處死解剖，用棉簽直接取腹腔液塗片，用火柴棒取墨汁與其混合均勻，加蓋玻片，盡量避免產生氣泡，置顯微鏡下觀察有無新型隱球菌寬厚莢膜和芽生孢子。

 

　　2．2  改良方法［2］  （1）將新型生球菌接種於沙氏斜麵培養基上，置37℃培養至肉眼可見培養基表麵有菌生長(約2天)。(2)將無菌兔血清加入沙氏斜麵培養物中，其量約占斜麵高度一半。然後傾斜試管，使血清完全淹沒整個斜麵。再將試管直立。置37℃培養5～8天。(3)取上述培養基靠近液麵處的培養物少許與一滴墨汁在玻璃片上混合，加上蓋玻片，輕壓，使標本混合變薄，在低倍鏡下尋找有莢膜的菌細胞，找到後轉換高倍鏡確認。

 

　　3  實驗結果 

 

兩種方法均能找到菌體大且莢膜肥厚的新型隱球菌。4  討論(1) 傳統方法雖能獲得滿意結果，但操作繁雜，耗時長，實驗過程中易汙染環境。(2) 改良培養方法，實驗材料易獲得，操作簡便安全，獲得的菌體形態典型。（3）經多次實驗發現，傳統方法在小白鼠體內實驗獲得的新生隱球菌多且芽生現象明顯，莢膜直徑較改良方法稍大。

 

作者：王 婭，馮桂香，金誌雄，朱明磊    作者單位：442000 湖北十堰,鄖陽醫學院病原學實驗室

 

【參考文獻】

  　1 李凡，劉晶星.醫學微生物學.北京： 人民衛生出版社，2008，340-341.

　　2 黃小珠.新型隱球菌培養方法.衛生職業教育,2007， 25（5）：108.