病毒感染的實驗室診斷（3）

三、病毒核酸及抗原的直接檢出

 

(一)直接檢出病毒核酸

 

1.核酸雜交(Nucleic acid hybridization) -臨床病毒學中報速診斷方法通常是檢測標本中的病毒抗原，然而核酸分子雜交具有高度敏感性和特異性，斑點雜交 (Dot hybridization) 廣泛用於檢測呼吸道標本，尿標本中的病毒核酸。標本滴加到硝酸纖維素膜上，病毒DNA結合到膜上，在原位進行鹼變性處理後，有放射標記的已知病毒DNA片段雜並，兩條單股核酸按鹼基到補原則結合成雙股，經放射自顯影，陽性結果出現斑點狀雜交信號。含輪狀病毒的糞便標本經熱變性處理，點到膜上，使用輪狀病毒體外轉錄的放射標記探針做斑點雜交，敏感性高於ELISA。腸道病毒也可用互補的DNA探針做斑點雜交。

 

目前核酸分子雜交不但用來檢測急性病人標本中的病毒DNA，也用於檢測不易分離培養的慢性感染、潛伏感染、整合感染病人標本中的病毒DNA。

 

2.多聚酶鏈反應 (Polymerase chain reaction, PCR) 一種體外基因擴增法。先將待檢標本DNA熱變性為單股DNA做為模板，加一對人工合成的與模板DNA兩端各20個鹼基互補的引物，在耐熱DNA多聚酶作用下，使四種脫氧核苷按模板3ˊ端引物向5ˊ端延伸DNA鏈，經20～40個循環，可使1個拷貝的核酸擴增至106以上，經瓊脂糖電泳，可見到溴化乙錠染色的核酸條帶，擴增片段的大小取決於兩引物的間距。此法較核酸雜交敏感、快速，已用於肝炎、AIDS、皰疹病毒感染診斷，尤其適用於不易分離培養及含量極少的病毒標本，有較大應用前景。

 

(二)直接檢測病毒抗原

 

1.免疫熒光(IF)技術 如前所述IF可用於細胞培養病毒的鑒定，也適用檢測臨床標本中病毒抗原，具有快速、特異的優點。直接免疫熒光技術是用熒光素直接標記特異性抗體，檢測病毒抗原；間接免疫熒光技術是先用特異性抗體與標本中抗原結合，再用熒光素標記的抗體與特異性抗體結合，從而間接識別抗原。可取咽喉脫落細胞，檢測呼吸道合胞病毒、流感及副流感病毒抗原；取病灶刮片或腦活檢標本，檢測單純皰疹病毒抗原；取尿沉渣檢測巨細胞病毒抗原等。近年來使用單克隆抗體大大提高了檢測的靈敏度和準確性。

 

2.免疫酶法(IEA) 原理與應用範圍同免疫熒光技術，IEA是用酶(通常是過氧化物酶)取代熒光素標記抗體，酶催化底物形成有色產物，在普通光學顯微鏡下清晰可見，不需熒光顯微鏡，便於推廣使用。

3.放射免疫測定法(RIA) 有競爭RIA和因相RNA二種方法。競急RIA是同位素標記的已知抗原與標本中未標記的待檢抗原競爭性結合特異性抗體的試驗，將形成的複合物分離出來，用放射免疫檢測儀測定放射活性，同時與係列稀釋的標準抗原測定結果進行比較，確定出待檢抗原的濃度。因相RIA是用特異性抗體包被因相以捕獲標本中的抗原，然後加入放射性標記的特異性抗體與抗原結合，測定放射活性，得知抗原的量。RIA是最敏感的方法，已用於測定糞便中甲肝病毒、輪狀病毒抗原及血液中乙肝病毒抗原。

 

4.酶聯免疫吸附試驗(ELISA) 先將特異性抗體包被(吸附)到塑料微培板孔中以捕捉標本中相應抗原，然後加入酶標特異性抗體，相應抗原被夾在抗體之間，當加入酶的底物後顯色，顯色程度直接反映了標本中病毒抗原的量。因其敏感性接近RIA，又不接觸放射性物質，已被多數實驗室采用。

 

此外，對難以分離培養，形態特殊且病毒數量較多的標本，可用電鏡或免疫電鏡法直接觀察，是一種快速診斷與鑒定病毒的方法，如輪狀病毒、乙肝病毒。