病毒感染的實驗室診斷（2）

二、病毒的分離與鑒定

 

(一)病毒的分離

 

病毒分離的一般程序見表80-3。

 

表80-3 病毒分離的一般程序

 

淋巴細胞培養(Lymphocyte culture) 正常成熟的淋巴細胞不經特殊處理不能在體外傳代培養。然而EBV感染的B淋巴細胞卻能在體外持續傳代，這是病毒轉化細胞的例證，也是分離出EBV的標誌。T淋巴細胞在加入T細胞生長因子(IL-2)後可在體外培養，為研究人類逆轉錄病毒(HIV、HTLV)提供了條件，HIV在T淋巴細胞培養物中增殖形成多核巨細胞。

 

2.動物試驗 這是最原始的病毒分離培養方法。常用小白鼠、田鼠、豚鼠、家兔及猴等。接種途徑根據各病毒對組織的親嗜性而定，可接種鼻內、皮內、腦內、皮下、腹腔或靜脈，例如嗜神經病毒(腦炎病毒)接種鼠腦內，柯薩奇病毒接種乳鼠(一周齡)腹腔或腦內。接種後逐日觀察實驗動物發病情況，如有死亡，則取病變組織剪碎，研磨均勻，製成懸液，繼續傳代，並作鑒定。

 

3.雞胚培養 用受精孵化的活雞胚培養病毒比用動物更加經濟簡便。根據病毒的特性可分別接種在雞胚絨毛尿囊膜、尿囊腔、羊膜腔、卵黃囊、腦內或靜脈內，如有病毒增殖，則雞胚發生異常變化或羊水、尿囊液出現紅細胞凝集現象，常用於流感病毒及腮腺炎病毒等的分離培養；但很多病毒在雞胚中不生長。

 

 

(二)分離病毒的鑒定

 

1.病毒在細胞內增殖的指征

 

(1)細胞致病作用(Cytopathogenic effect,CPE) 病毒在細胞內增殖引起細胞退形性變，表現為細胞皺縮、變圓、出現空泡、死亡和脫落。某些病毒產生特征性CPE，普通光學倒置顯微鏡下可觀察上述細胞病變，結合臨床表現可做出預測性診斷(表80-4)。免疫熒光(IF)法用於鑒定病毒具有快速、特異的優點，細胞內的病毒或抗原可被熒光素標記的特異性抗體著色，在熒光顯微鏡下可見斑點狀黃綠色熒光，根據所用抗體的特異性判斷為何種病毒感染。

 

表80-4 病毒在細胞內增殖的指征

 

 

(2)紅細胞吸附現象(Hemadsorption phenomenon) 流感病毒和某些副粘病毒感染細胞後24-48小時，以細胞膜上出現病毒的血凝素，能吸附豚鼠、雞等動物及人的紅細胞，發生紅細胞吸附現象。若加入相應的抗血清，可中和病毒血凝素、抑製紅細胞吸附現象的發生，稱為紅細胞吸附抑製試驗。這一現象不僅可作為這類病毒增殖的指征，還可作為初步鑒定。

 

(3)幹擾現象 (Interference phenomenon) 一種病毒感染細胞後可以幹擾另一種病毒在該細胞中的增殖，這種現象叫幹擾現象。前者為不產生CPE的病毒(如風疹病毒)但能幹擾以後進入的病毒(如ECHO病毒)增殖，使後者進入宿主細胞不再生產CPE。

 

2.病毒感染性的定量測定

 

空斑形成單位 (Plaque-forming unit ,PFU) 測定 這是一種測定病毒感染性比較準確的方法。將適當濃度的病毒懸液接種到生長單層細胞的玻璃平皿或扁瓶中，當病毒吸附於細胞上後，再在其上複蓋一層溶化的半固體營養瓊脂層，待凝固後，孵育培養。當病毒在細胞內複製增殖後，每一個感染性病毒顆粒在單層細胞中產生一個局限性的感染細胞病灶，病灶逐漸擴大，若用中性紅等活性染料著色，在紅色的的背景中顯出沒有著色的“空斑”，清楚可見。由於每個空斑由單個病毒顆粒複製形成，所以病毒懸液的滴度可以用每毫升空斑形成單位(PFU)來表示。

 

(2)50%致死量(LD50)或50%組織細胞感染量(TCID50)的測定 本法可估計所含病毒的感染量。方法是測定病毒感染雞胚，易感動物或組織培養後，引起50%發生死亡或病變的最小病毒量，即將病毒懸液作10倍連續稀釋，接種於上述雞胚，易感動物或組織培養中，經一定時間後，觀察細胞或雞胚病變，如絨毛尿囊膜上產生痘斑或尿囊液有血凝特性，或易感動物發病而死亡等，經統計學方法計算出50%感染量或50%組織細胞感染量，可獲得比較準確的病毒感染性滴度。

 

3.病毒形態與結構的觀察 病毒懸液經高度濃縮和純化後，借助磷鎢酸負染及電子顯微鏡可直接觀察到病毒顆粒，根據大小、形態可初步判斷病毒屬那一科。還可用分子生物學技術分析病毒核酸組成、基因組織構、序列同源性比較加以鑒定。

 

4.血清學鑒定 用已知的診斷血清來鑒定。補體結合試驗可鑒定病毒科屬；中和試驗或血凝搗蛋製試驗可鑒定病毒種、型及亞型。從病人檢材中分離出病毒株，應結合臨床症狀，檢材來源及流行季節等加以綜合分析，並應注意混雜病毒、隱性感染或潛伏病毒的混淆，須用病人急性期與恢複期雙份血清作血清學試驗，血清抗體滴度有≥4倍以上增高，才有意義。