【摘要】 目的 了解目前動物和人腸道共生的大腸埃希菌耐藥性，分析其產生的原因。方法 從甘肅、湖北、北京、山東、四川等地相對封閉的養殖場及養殖場附近的健康人群采集雞、豬、魚、人糞便樣本，分離大腸埃希菌。用API20E鑒定條鑒定懷疑為大腸埃希菌的菌種，采用KB紙片法檢測生化鑒定為大腸埃希菌的菌株的耐藥性，利用WHONET5.3軟件進行藥敏試驗數據分析。用脈衝場凝膠電泳技術檢測具有相似耐藥譜型的大腸埃希菌菌株間的同源性。結果 ①共收集571株大腸埃希菌，其中從海水養殖魚類和淡水養殖魚類分離31株，另從海水養殖魚類和淡水養殖魚類分離嗜水氣單胞菌株57株；②來源雞的大腸埃希菌對所有檢測的抗菌藥物的耐藥率最高；③除β內酰胺類抗生素和阿米卡星外，雞、豬和人來源菌株的耐藥率表現為高、中、低現象，對老的一些抗菌藥物和喹諾酮類抗菌藥物尤其明顯；不同地區分離株的耐藥性也有較大的差異；④本次調查首次在國內養雞場發現產ESBL大腸埃希菌，並且非常多見；⑤嗜水氣單胞菌和大腸埃希菌的耐藥性有較大的差異，47株耐藥譜型相近的菌株中發現了三組基因水平同源性菌株(相似度大於95%)。結論 ①從不同地區、不同種類動物分離菌株的耐藥性不同，與抗生素的使用情況相關。目前我國家禽養殖業濫用喹諾酮類和β內酰胺類尤其是三代頭孢菌素類抗生素的現象較為普遍，應該加以嚴格控製；②不同菌種的生物學特性不同，導致耐藥性不同；③同源性分析發現耐藥菌株可在同一種類動物間傳播，不同類動物的大腸埃希菌之間可能存在耐藥基因的水平傳播；④應當加強養殖動物分離的大腸埃希菌耐藥性監測。
【關鍵詞】 大腸埃希菌； 養殖場； 抗生素； 耐藥性
ABSTRACT Objectives To investigate the resistant profiles of Escherichia coli, the commensal intestinal isolates from pig, chicken, fish and healthy human beings. Methods E.coli isolates were recovered from fecal specimens of chicken, pig, fish and healthy human beings collected from farms of Gansu, Hubei, Shandong, Sichuan and Beijing areas. The isolates were identified by API20E system. The antimicrobial susceptibility of these isolates were tested by KB disk diffusion method, and the data were analyzed by WHONET5.3 software. Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) were applied to identify the homogeneity of 47 E.coli isolates which showed similar antimicrobial resistance profiles. Results Totally 571 E.coli isolates were recovered, include 31 seawater and freshwater cultivating fish isolates. Otherwise 57 Aeromonas hydrophila isolated from seawater and freshwater cultivating fish. The chicken isolates showed the highest resistant level compared to isolates from other sources. The antimicrobials susceptibility of the isolates from chicken, pig and human were low,middling and high respectively (except betalactams and amikacin). At the same time, the antimicrobials susceptibility of the isolates from five areas were different significantly. The extendedspectrum betalactamases (ESBLs) producing E.coli isolates were recovered from poultry farm. The resistant profiles oE.coli and Aeromonas hydrophila isolates collected from fish fecal specimens were different. With PFGE analysis, three group isolates were highly homogeneous. Conclusion Antimicrobial resistance of the isolates were widely distributed in
KEY WORDS Escherichia coli; Livestock farm; Antimicrobial; Resistance
細菌耐藥性是全球關注的熱門話題，近年我國對引起人類疾病臨床分離株的研究文獻較多，抗菌藥物在人類醫學領域以外使用造成耐藥性災害的報道不多。畜牧業抗生素的使用導致耐藥株的出現，並通過食物鏈傳播給人，對人類健康帶來嚴重威脅［1］。為此，國家科技部提供專項基金，由國家食品藥品監督管理局細菌耐藥性監測中心在我國湖北、山東、甘肅、四川和北京四省一市開展調研，現將對共生於動物及健康人腸道的大腸埃希菌的耐藥性及產生的原因報告如下。
1 材料和方法
1.1 標本采集和菌種分離鑒定
(1)樣本的采集 2006～2007年在湖北恩施、山東半島、北京門頭溝、甘肅酒泉和四川新都地區各選擇2個以上的比較封閉的養雞場、養豬場和養魚場，用英國Oxoid公司生產的采樣拭子采集雞、豬、魚、正常人糞便樣本。
(2)細菌的分離鑒定 先采用丹麥血清所生產的腸道菌分離鑒定用瓊脂平板進行大腸埃希菌的分離，用北京三藥藥品生物製品開發公司生產的伊紅美蘭瓊脂平板傳純菌株。純菌株的鑒定采用法國BioMerieux公司的API20E腸杆菌科細菌鑒定條。
1.2 藥敏試驗
采用KB紙片法，質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922和ATCC35218由美國疾病控製中心提供。大腸埃希菌和嗜水氣單胞菌藥敏試驗方法與判定標準分別參照美國臨床實驗室標準化研究所(CLSI)M100S17［2］和M45A［3］。MH瓊脂平板購自天津金章科技開發公司。藥敏紙片為英國Oxoid產品和北京天壇藥物生物技術開發公司的產品，紙片的藥物含量參照CLSI標準。產超廣譜β內酰胺酶(ESBLs)菌株的確證采用雙紙片法。
1.3 數據分析
藥敏試驗數據分析采用世界衛生組織細菌耐藥性監測中心推薦的WHONET5.3軟件進行。
1.4 菌株間同源性分析
(1)主要試劑 限製性內切酶XbaI購自大連寶生物公司；SeaKem Gold瓊脂糖購自美國Cambrex公司；蛋白酶K為德國Merck公司產品；十二烷基肌氨酸鈉、Tris base、EDTA、苯甲基磺酰氟(PMSF)、硼酸等均為美國Sigma公司產品。
(2)主要儀器 脈衝場凝膠電泳儀CHEF Mapper電泳儀和凝膠成像係統Gel/ChemiDoc係統均為BIORID公司產品。
(3)PFGE 操作方法參照美國CDC建立的PulseNet提供的方法。
(4)數據分析 將PFGE得到的電泳圖譜采用BioNumerics軟件(ver4.0)進行分析，以不加權成對算術平均法(unweighted pairgroup method with arithmetic average，UPGMA)為手段進行聚類分析。
2 結果
2.1 分離菌株的耐藥性
從甘肅、湖北、北京、山東、四川四省一市采集雞、豬、魚、人糞便樣本共分離大腸埃希菌571株，其中從雞、豬和人糞便樣本分離大腸埃希菌共540株，它們對常規監測用抗生素的耐藥性和主要耐藥譜型分別見表1和表2。從海水養殖魚類和淡水養殖魚類共分離嗜水氣單胞菌57株和大腸埃希菌31株，其耐藥性見表3。
2.2 不同地區動物、人源性大腸埃希菌產超廣譜β內酰胺酶(ESBL)菌株分離情況
經CLSI推薦的確證試驗證明本次調查共有65株大腸埃希菌為產ESBL菌株，其中以雞來源菌株的分離率最高，其次為人源菌株，豬分離菌株未發現產ESBL菌株。不同地區動物、人源性大腸埃希菌產ESBL菌株分離情況見表4。
2.3 耐藥性相似的大腸埃希菌菌株同源性分析
采用XbaI作為內切酶，對來自湖北恩施地區和甘肅酒泉地區耐藥表型相似的47株大腸埃希菌菌株進行PFGE同源性分析。以95%的相似度為界限，來自同一養雞場的大腸埃希菌xiao39、xiao27、xiao35，同一養豬場的大腸埃希菌p44和p60和養雞場周圍人群分離的hj18和hj21b分別為同源菌株；47株菌可以分成40個PFGE型別， 在不同動物種群、不同地區間未 表1 五地區雞、豬和人來源大腸埃希菌對常規監測抗菌藥物的耐藥性表2 五地區雞、豬和人來源大腸埃希菌主要耐藥譜型比較表3從魚分離到嗜水氣單胞菌和大腸埃希菌表4 不同地區動物/人源性大腸埃希菌產發現同
3 討論
大腸埃希菌是動物腸道正常菌群的一部分，在食品生產、加工和銷售過程中該菌常被作為糞便汙染的指示菌。在畜牧養殖業過程中，無論抗菌藥物是作為治療用還是作為促生長劑用，在抗菌藥物的選擇性壓力下，腸道細菌很易產生耐藥性變化［4，5］。因此，在本次養殖業中抗菌藥物使用與細菌耐藥性的危險評估的調查中，將大腸埃希菌作為代表菌用以研究和評估畜牧業使用抗菌藥物對正常菌群耐藥性的影響。
(1)本次調查收集了甘肅、湖北、北京、山東、四川等地雞、豬、魚、人糞便樣本大腸埃希菌571株，其中雞、豬和人糞便樣本大腸埃希菌540株。耐藥檢測可見雞來源的大腸埃希菌對所有檢測的抗菌藥物的耐藥率最高。除β內酰胺類抗生素和阿米卡星外，雞、豬和人來源菌株的耐藥率表現為高、中、低現象，對一些老抗菌藥物和喹諾酮類抗菌藥物尤其明顯。耐藥表型分析也證明，雞來源的大腸埃希菌多重耐藥株更多，且更複雜。據不完全統計，國內數百噸的喹諾酮類抗生素被用於畜牧業，其中絕大部分是作為食用動物促生長劑來喂養家禽、豬、羊、牛甚至魚。本文調查的現場詢問表明，諾氟沙星常加在動物飲用水中，以0.01%～0.04%濃度給養殖家禽飲用。調查發現，雞分離的大腸埃希菌對萘啶酸、環丙沙星和加替沙星的耐藥率分別為88.6%、54.3%和43.5%，豬分離株分別為49.7%、19.9%和19.9%，健康人分離株分別為36.6%、14.4%和13.8%，可見喹諾酮類藥物的耐藥率非常高。喹諾酮類藥物是治療人類感染的重要抗菌藥物之一，沙門菌和空腸彎曲菌喹諾酮耐藥菌株可通過食物鏈傳播給人類［6～8］，這是對人類感染治療的嚴峻挑戰，因此畜牧業濫用喹諾酮應該加予嚴格控製。
(2)近年來，臨床大腸埃希菌產ESBLs菌株逐年增加，已引起各國臨床微生物研究人員和醫生的高度關注［9～13］。有關產ESBLs菌株的研究報道絕大多數是住院患者，但在患病動物分離產ESBLs菌株的報道並不多見［14～16］，從健康動物分離產ESBLs株的報道更少［17，18］。本次調查首次在國內養雞場發現產ESBL大腸埃希菌，並且非常多見，其中四川新都雞來源產ESBLs菌株最為多見，分離率高達50%；其次為北京門頭溝地區雞來源菌株。β內酰胺酶產生的機製主要為誘導產生，因此國內養雞場產ESBLs大腸埃希菌的出現間接說明我國養殖業，特別是家禽養殖業濫用抗生素的現象比較普遍。據我們所知，在家禽養殖業中一日齡雛雞多注射頭孢噻呋(ceftiofur是一種第三代頭孢菌素，獸用製劑為鈉鹽)用於預防感染，我們認為這是雞分離株產ESBL株分離率高的原因。
(3)從海水養殖魚類和淡水養殖魚類共分離嗜水氣單胞菌57株和大腸埃希菌31株，檢測表明魚分離的嗜水氣單胞菌對四環素的耐藥率為8.8%，對阿莫西林/克拉維酸的耐藥率達到93.0%，對其它抗菌藥物都幾乎敏感，明顯低於分離於魚的大腸埃希菌，說明菌種耐藥性的產生與菌種本身的生物學特性也有關聯，大腸埃希菌更容易產生耐藥性。
(4)用脈衝場電泳方法對47株耐藥性相似的菌株進行同源性分析，發現來自同一養雞場的大腸埃希菌xiao39、xiao27和xiao35，同一養豬場的大腸埃希菌p44和p60和養雞場周圍人群分離的hj18和hj21b分別為同源菌株，說明耐藥菌株可在同一種群內傳播和蔓延；本研究未發現在不同種群間同
(5)本次調研也存在一定的局限性：①在數以千計家禽的養殖場內，我們采集的標本所占比例相對低，樣本的代表性相對較差。此外，雞分離菌株數遠多於人分離菌株，從現有菌株中發現動物直接傳播到人的證據幾率可能較低；②由於大腸埃希菌有上百種以上的血清型、生化型，僅從耐藥譜型相似就進行同源性分析，其可行性存在一定的問題；③到目前為止，在養殖場健康動物中耐藥菌株傳播的資料缺少。雖然我們在交通相對閉塞的養殖場中采集了養殖場動物和養殖場附近居民的菌株，發現種內(相同動物或人)耐藥菌株傳播蔓延的直接證據，但種間(動物與人之間)耐藥菌株的傳播有待繼續深入研究。雖然有很多資料闡述畜牧業使用抗菌藥物對人類健康存在潛在威脅，而這一潛在威脅主要表現在食物鏈上，但多數資料主要表現在個例報道［19］以及食源性病原菌食物中毒暴發中［20～21］。同源性分析結果同時說明動物中分離的耐藥菌株不是人身上的耐藥菌株傳播過去的，抗生素的選擇性壓力導致了耐藥菌株播散以及耐藥基因的水平傳播。
(6)細菌耐藥性產生和流行的主要原因是抗生素選擇性壓力和耐藥基因的水平傳播，同時經濟發展導致的人口流動，人們的生活習慣(如養殖場工作人員、醫護人員等是否經常洗手)，耐藥基因的儲存宿主菌在環境中的分布及自身特性等等都會影響到耐藥菌株的傳播和流行。我國各地區動物源性菌株的耐藥性存在較大差異，間接反映了不同地區使用抗菌藥物的種類和量的不同，養殖業濫用抗菌藥物的現象非常普遍，後果也很嚴重。2002年WHO出版了抗生素使用監測報告和中止抗生素作為促進生長劑使用報告書。丹麥飼用抗生素監測結果已經證明，控製和禁止把抗生素作為飼料添加劑對於遏製細菌耐藥性在動物中的出現和傳播具有重要意義，我國農業部、衛生部和國家食品藥品監督管理局2002年公布《禁止在飼料和動物飲水中使用藥物品種目錄》，為保護抗生素資源，確保對人類健康極為重要的抗生素品種［1］，特別是人類一線用藥(如第三代頭孢菌素、喹諾酮類抗生素)，加強監管，控製或禁止養殖業使用，以減少獸用藥對臨床治療帶來的危害，十分重要。同時，為遏製細菌耐藥性的產生和傳播，環境分離株耐藥性監測需要引起相關部門的高度注意，並且要長期堅持下去，結合臨床分離株耐藥性的監測為製定合理的抗生素應用政策提供參考依據。
作者：李景雲 崔生輝 馬越 胡昌勤《中國抗生素雜誌》
【參考文獻】
［1］ 金少鴻. 抗生素在人類醫學領域以外使用的危險控製策略［J］. 中國抗生素雜誌，2005，30(6)：321～323.
［2］ Clinical Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; 17th informational supplement. M100S16 ［S］. Wayne Pennsylvania:CLSI,2007:32～37.
［3］ Clinical Laboratory Standards Institute. Methods for antimicrobial dilution and disk susceptibility testing of infrequently isolated or fastidious bacteria; approved guideline. M45A ［S］. Wayne Pennsylvania:CLSI,2007:12～13.
［4］ Quednau M, Ahrne′ S, Petersson A C, et al. Antibiotic resistant strains of Enterococcus isolated from Swedish and Danish retailed chicken and pork ［J］. J Appl Microbiol,1998,84:1163～1170.
［5］ Turtura G C, Massa S, Ghazvinizadeh H. Antibiotic resistance among coliform bacteria isolated from carcasses of commercially slaughtered chickens ［J］. Int J Food Microbiol,1990,11(3～4):351～354.
［6］ Smith K E, Besser J M, Hedberg C W, et al. Quinoloneresistant Campylobacter jejuni infections in
［7］ Molbak K, Baggesen D L, Aarestrup F M, et al. An outbreak of multidrugresistant, quinoloneresistant Salmonella enterica serotype typhimurium DT104 ［J］. New Engl J Med,1999,341:1420～1425.
［8］ Glynin M K, Bopp C, Dewitt W, et al. Emergence of multidrugresistant Salmonella enterica serotype typhimurium DT104 infections in the
［9］ Bou G, Cartelle M, Tomas M, et al. Identification and broad dissemination of the CTXM14 βlactamase in different Escherichia coli strains in the northwest area of
［10］ Coque T M, Oliver A, Pe′rezDíaz J C, et al. Genes encoding TEM4, SHV2, and CTXM10 extendedspectrum βlactamases are carried by multiple Klebsiella pneumoniae clones in a single hospital (Madrid, 1989 to 2000) ［J］. Antimicrob Agents Chemother,2002,46(2):500～510.
［11］ 馬越，李景雲，張新妹，等. 2002年臨床常見細菌耐藥性監測［J］. 中華檢驗醫學雜誌，2004，27(1)：38～45.
［12］ 陳民鈞. 細菌對β內酰胺藥的耐藥性及檢測方法［J］. 中華檢驗醫學雜誌，2001，24(4)：197～200.
［13］ 馬越，李景雲，張新妹，等. 1999～2002年北京/廣東/湖北和遼寧地區大腸埃希氏菌及肺炎克雷伯氏菌臨床分離株耐藥性比較分析［J］. 中國抗生素雜，2004，29(4)：226～234.
［14］ Winokur P L, Vonstein D L, Hoffman L J, et al. Evidence for transfer of CMY2 AmpC βlactamase plasmids between Escherichia coli and Salmonella isolates from food animals and humans ［J］. Antimicrob Agents Chemother,2001,45(10):2716～2722.
［15］ Féria C, Ferreira E, Correia J D, et al. Patterns and mechanisms of resistance to βlactams and βlactamase inhibitors in uropathogenic Escherichia coli isolated from dogs in
［16］ Bradford P A, Petersen P J, Fingerman I M, et al. Characterization of extendedspectrum cephalosporin resistance in E.coli isolates associated with bovine calf diarrhoeal disease ［J］. J Antimicrob Chemother,1999,44(5):607～610.
［17］ Brias, Zarazaga L M, Saenz Y, et al. βlactamase characterization in ampicillinresistant Escherichia coli isolates obtained from foods, humans, and healthy animals ［J］. Antimicrob Agents Chemother,2002,46(10):3156～3163.
［18］ Brias, L, Moreno M A, Zarazaga M, et al. Detection of CMY2, CTXM14, and SHV12 βlactamases in Escherichia coli fecalsample isolates from healthy chickens ［J］. Antimicrob Agents Chemother,2003,47(6):2056～2058.
［19］ Glynn M K, Bopp C, Dewitt W, et al. Emergence of multidrug resistant Salmonella enterica serotype typhimurium DT104 infections in the
［20］ Helmuth R, Protz D. How to modify conditions limiting resistance in bacteria in animals and other reservoirs ［J］. Clin Infect Dis,1997,24(Suppl):S136～S138.
［21］ JacobsReitsma W, Kan C A, Bolder N M. The induction of quinolone resistance in Campylobacter bacteria in broilers by quinolone treatment ［J］. Lett Appl Microbiol,1994,19(4):228～231.
