糖基轉移酶2基因silD在大腸埃希菌中的克隆與表達

【摘要】  從伊紐小單孢菌(Micromonospora inyoensis)擴增參與西索米星生物合成的糖基轉移酶基因silD(1181bp)，並分別將其克隆到pUC18和表達載體pET30a上。其開放性閱讀框長1173bp，編碼含390aa(43.04ku)的多肽鏈，在大腸埃希菌BL21(DE3)::pETsilD中實現表達。基因silD的堿基序列與gntD(來自M.echinospora)的堿基序列的同源性高達94%。預測的SilD蛋白序列與GntD的同源性為98%。這是繼從依紐小單孢菌克隆參與生物合成西索米星的抗性基因srm1(AY661430)、西索米星2脫氧蟹肌醇合成酶基因sisB(DQ250993)和糖基轉移酶基因sisZ(DQ250994)後，克隆到的又一新基因。該基因在GenBank的接受號為DQ250992。基因silD的克隆和表達為進一步研究其生物學功能奠定了基礎。

【關鍵詞】  糖基轉移酶2基因； 伊紐小單孢菌； silD；克隆與表達

    ABSTRACT  The gene silD, a novel glycosyl transferase2 gene, was cloned in our laboratory. The DNA fragment containing silD (1185bp) gene (the key gene involved in sisomicin biosynthesis) was isolated from Micromonospora inyoensis and cloned into pUC18 vector. Its ORF is composed of 1,173 bp, encoding 390aa (43.04ku). Sequence analysis verified that silD gene and amino acids sequence showed 94% and 98% identity with gntD (glycosyltransferase gene for gentamicin biosynthesis from M.echinospora), respectively. The prediction of structure of silD suggested it is also a glycosyl transferase protein. The silD expression vector pETsilD was constructed by fusion of the flanking silD ORF in the pET30a plasmid. The silD protein was expressed by IPTG induction in E.coli BL21(DE3):: pETsilD. The successful expression of silD in the E.coli BL21(DE3):: pETsilD will facilitate the further function analysis of the novel gene silD in Micromonospora inyoensis. The silD is a novel gene after cloning the sisomicin resistance gene srm1, glycosyl transferase gene sisZ and 2deoxy scyllo inosose synthase gene sisB from Micromonospora inyoensis.

    KEY WORDS  Glycosyl transferase2 gene;  Micromonospora inyoensis;  silD;  Clone and expression

    放線菌中的小單孢菌屬微生物能產生重要的氨基糖苷類抗生素，而氨基糖苷類抗生素是臨床上重要的抗感染藥物。伊紐小單孢菌(Micromonospora inyoensis)產生的西索米星及其相關的衍生物奈替米星被譽為第三代氨基糖苷類抗生素，是氨基糖苷類抗生素中不良反應最少、抗銅綠假單胞菌作用最強、抗鈍化酶能力最廣的抗生素，世界衛生組織(WHO)將奈替米星列為對人類健康極其重要的抗感染藥物。

    西索米星生物合成途徑還未在基因組水平上得到深入研究。采用突變阻斷試驗，並對突變合成和代謝途徑中的中間體進行分析，結果表明西索米星存在複雜的生物合成機製，至少需要連續七步酶促反應步驟，估計參與西索米星生物合成的酶基因有幾十個，因為慶大黴素生物合成基因簇總共由30個基因組成［1］。考慮到這些微生物及其藥物的重要性，揭開它們生物合成基因簇的排列方式和調節機製是非常有意義的。

    近十多年，已從幾株重要的產抗生素小單孢菌中克隆到幾個氨基糖苷類抗生素抗性基因，如從絳紅小單孢菌和玫瑰小單孢菌中分離到慶大黴素抗性基因grmA和grmB，從茲昂小單孢菌克隆到sgm，從伊紐小單孢菌中分離到sisA等［2～5］。隨著對小單孢菌抗性基因研究的不斷取得進展［6］，對這類小單孢菌生物合成基因簇的研究也進入了高潮，而且對產同一種抗生素的不同產生菌的基因簇都同時得到了研究，如產慶大黴素的絳紅色小單孢菌基因簇［7］和棘孢小單孢菌的基因簇［1，6］。產氨基糖苷類抗生素的其它產生菌同樣受得了高度重視，如產卡那黴素的卡那黴素鏈黴菌的生物合成基因簇［8］、產妥布黴素的黑暗鏈黴菌的基因簇［9，10］，產核糖黴素的核糖苷鏈黴菌的基因簇［11］等。目前國內、外對依紐小單孢菌基因簇的研究報道得不多，而西索米星又是一個對人類健康極其重要的抗生素，因此克隆研究參與西索米星生物合成基因及其基因組的排列和調控機製等非常必要。

    本研究繼從依紐小單孢菌克隆到西索米星抗性基因srm1(AY661430)、西索米星糖基轉移酶基因sisZ(DQ250994)和蟹肌醇合成酶基因sisB(DQ250993)後，又從依紐小單孢菌克隆到一個參與西索米星生物合成的基因——糖基轉移酶2基因silD(GenBank登記號為DQ250992)。本文報道糖基轉移酶基因2 silD的克隆表達及其核苷酸、氨基酸序列等。

    1  材料和方法

    1.1  材科

    1.1.1  菌種與質粒  伊紐小單孢菌(M.inyoensis)TS388由福州大學提供；大腸埃希菌BL21(DE3)、大腸埃希菌DH5a和質粒pUC18均由上海來益生物藥物研發中心提供；表達載體為pET30a購自Novagen公司。其它常用化學藥品及試劑購自上海生物工程公司和華美公司。

    1.1.2  培養基  LB培養基［12］根據需要添加氨苄西林(終濃度100mg/ml)和卡那黴素(終濃度50μg/ml)；用於伊紐小單孢菌TS388生長的培養基見文獻［13］。

    1.1.3  主要試劑  所有工具酶購自TaKaRa公司；氨苄西林(ABPC)和卡那黴素為華美生物工程公司產品；瓊脂糖為Pharmacia產品；PCR引物由上海生物工程公司合成；DNA序列由TaKaRa公司測定。

    1.2  DNA操作和基因silD克隆及其測序

    伊紐小單孢菌TS388染色體DNA的提取參照文獻［13］；質粒DNA采用堿裂解法提取［12］，DNA酶切、連接等均按產品說明書進行；采用CaCl2方法製備感受態細胞，在含有抗生素的選擇性培養基上篩選陽性轉化子。DNA采用試劑盒回收(購自TaKaRa公司)。

    從GenBank中選擇與伊紐小單孢菌親緣關係比較接近的、產慶大黴素的棘孢小單孢菌(Micromonospora echinospora)的慶大黴素生物合成基因簇中的糖基轉移酶基因gntD作為引物設計的參考模板(AY524043)，設計一對簡並引物，正向引物為：GAGAATTCATGGGCGGCATGCACGT(EcoRI)；反向引物為：ACCTGCAGCGGTCATCTCAGGACTC(PstI)。PCR循環條件為：94℃預變性5min；94℃變性1min，64℃複性1min，72℃延伸2min，循環30次；最後72℃保溫10min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳回收，克隆到pUC18載體上，陽性克隆子被命名為pLYsilD，並送TaKaRa公司測序，所得序列應用vector NTI 9.1和Blast軟件進行序列比對和結構預測。

    1.3  融合蛋白表達載體的構建及分析

    提取陽性克隆子pLYsilD和pET30a質粒，分別經EcoRIHindIII雙酶切，分離回收silD片段和pET30a載體，經酶切連接、轉化，挑單個陽性克隆(大腸埃希菌BL21::pETsilD)到添加卡那黴素的LB培養基中，取1ml菌液加入到含50ml的LB中，培養到A600為0.6～0.8後加入IPTG(終濃度為1mmol/L)誘導0～4h，取50μl菌液，加2×SDS蛋白上樣緩衝液混合，沸水中煮沸5min，冰上放置5min，然後於15000r/min離心1min，沉澱收集到管底，取上層樣品液20μl進行SDSPAGE電泳檢測。

    2  結果與討論

    2.1  重組子的構建和克隆

    引物設計策略。從GenBank基因庫查找已公布的有關抗生素生物合成的相關基因或基因簇，經比較後選擇與依紐小單孢菌親緣關係比較接近的、產慶大黴素的棘孢小單孢菌的慶大黴素生物合成基因簇中的糖基轉移酶基因gntD作為引物設計的參考模板，設計簡並引物(1.2)，通過改變PCR複性溫度，得到了目的片段(1181bp)，命名為silD。silD的擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見Fig.1。

    設計了不同的複性溫度梯度進行PCR嚐試，找到了適合擴增目標片段的合理溫度為64℃～68℃(Fig.1中Lane 4～6)，不加exTaq酶作對照。

    從Fig.1可以看出，采用該策略設計的簡並引物，    Lane 1: DL2000 marker;  Lane 2～8: the PCRproducts;

    Lane 2 60.0℃, Lane 3 61.6℃, Lane 4 64.1℃, Lane 5 65.5℃,

    Lane 7 68.1℃;  Lane 8: the PCRproducts (without exTaq,

    control, 65.0℃);  Lane 9: λDNA/HindIII marker

    Fig.1    The electrophoresis of PCRproducts from

    genomicDNA of Micromonospora inyoensis

    經PCR擴增，得到了比較理想的單一條帶(1181bp)，說明該簡並引物的設計策略和探索的擴增條件是合理可行的。

    PCR擴增獲得的DNA(silD)片段經瓊脂糖凝膠電泳分離，回收，經相應的限製性酶(EcoRIPstI)切割，並與被同樣雙酶切的pUC18載體進行連接，然後轉化大腸埃希菌DH5α感受態細胞,構建含silD擴增片段的亞克隆子，經藍白斑篩選，得到了陽性克隆子，命名為pLYsilD。

    2.2  重組質粒pLYsilD的鑒定及其分析

    將2.1獲得的pLYsilD陽性克隆子經EcoRIPstI雙酶切、EcoRI單酶切和PstI單酶切電泳檢測，初步確認其陽性克隆子是目標克隆子(酶切電泳檢測結果見Fig.2，外源DNA片段silD的限製性酶切位點見Fig.3)。經測序，pLYsilD的DNA序列總長為1181bp，對應於ORF的氨基酸序列為390aa。

2.3  基因silD的核苷酸序列在核苷酸水平的比較不重要應簡略及其氨基酸序列分析

    來自伊紐小單孢菌的擴增DNA片段(EcoRIPstI)總長1181bp。借助vector NTI軟件尋找開放性閱讀框(ORF)，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA，其orf總長1173bp(1～1173bp)。根據silD基因與gntD所具有的高度同源性，並參照gntD基因的研究結果，認為silD基因是依紐小單孢菌生物合成基因簇中的合成西索米星的重要基因：糖基轉移酶基因2。基因silD的核苷酸序列、氨基酸序列等詳細情況可登錄GenBank查找(DQ250992)。

    silD表達的蛋白由390個氨基酸(aa)組成，其蛋白分子質量約為43.04ku，等電點為6.46。對silD密      plasmids pLYsilD by restriction endonuclease digestion.

    Lane 1: DL2000 marker;  Lane6: λDNA/HindIII marker;

    Lane 2: pLYsilD digested by EcoRIPstI;

    Lane 3: pLYsilD digested by EcoRI;

    Lane 4: pLYsilD digested by PstI;

    Lane 5: pUC18 digested by EcoRIPstI (control)

    Fig.2    Electrophoresis Gel analysis of the recombinant

    Fig.3    Gene silD and its restriction endonuclease site

    碼子序列來說，其G和C在密碼子的第1、2和3位置的使用率分別為70.8%，39.2%和93.1%，silD基因G+C的含量為67.6%，與gntD基因的68.5%非常接近。該基因的GC含量略低於小單孢菌類DNA中G+C含量的平均值71%～73%。

    2.4  silD基因的DNA序列及其氨基酸序列比對

    基因silD DNA比對擊中8個分子，排在前2位的是與氨基糖苷類抗生素生物合成基因簇有關的，且同源性比較高，它們依次是：①產慶大黴素的絳紅色小單孢菌中的基因簇，同源性94%(Micromonospora echinospora ATCC 15835 gentamicin biosynthesis；AY524043)；②產妥布黴素的黑暗鏈黴菌的基因簇，同源性84%(Streptomyces tenebrarius tobramycin biosynthetic gene cluster；AJ579650)。其餘同源性較低的不一一說明。總之，從比對結果可以確定silD基因是依紐小單孢菌中控製西索米星生物合成的糖基轉移酶基因。國內、外未見報道從產西索米星的依紐小單孢菌中克隆到這樣的糖基轉移酶基因，這是繼從依紐小單孢菌中克隆到西索米星高抗性基因srm1(AY661430)等之後，從產西索米星菌中克隆到與西索米星生物合成有關的又一新基因。

    預測的氨基酸序列與gntD的氨基酸序列的比對，其同源性為98.2%。

    2.5  pETsilD克隆子的構建

    提取pLYsilD亞克隆質粒，經EcoRIHindIII雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳分離，回收1199bp的DNA片段，並與被同樣雙酶切的pET30a載體進行連接，然後轉化大腸埃希菌BL21(DE3)感受態細胞，經卡那黴素抗性篩選得到了陽性克隆子，命名為pETsilD。pETsilD的EcoRIHindIII雙酶切(Lane 2)、EcoRI單酶切(Lane 3)和HindIII單酶切(Lane 4)的電泳鑒定結果見Fig.4。

    2.6  基因silD表達蛋白的檢測

    將以上利用原核表達載體pET30a構建含silD基因的融合表達載體(pETsilD)，轉化到大腸埃希菌BL21(DE3)菌株，IPTG誘導，silD基因蛋白得到正常表達，表達蛋白的SDSPAGE電泳檢測結果見Fig.5，檢測結果表明silD基因能在大腸埃希菌BL21(DE3)中實現表達。

    從Lane 7沒有檢測到表達蛋白，說明表達蛋白停留在胞內，沒有分泌到細胞外。

    3  結論

小單孢菌作為生物代謝產物合成藥物的重要來源，已越來越受到人們的重視，揭開西索米星生物合成及其調控機製，對該類物種的改良開辟了新途徑。采用    Lane 1: pETsilD no induced by IPTG (control);PCR技術，已從伊紐小單孢菌的染色體DNA擴增到四個特定的DNA片段，本次克隆到的DNA片段長1185bp，被命名為silD，經計算機分析和Blast比對得知，序列內含有一個ORF，編碼390aa(43.04ku)的多肽鏈。基因silD屬西索米星生物合成基因簇中的糖基轉移酶2基因。該DNA片段先後依次被克隆到pUC18篩選載體和表達載體pET30a上，並在大腸埃希菌BL21(DE3)::pETsilD中實現表達。基因silD的堿基序列與來自棘孢小單孢菌的gntD的堿基序列的同源性高達94%。預測的SilD蛋白序列與GntB的同源性為98%。基因silD是從依紐小單孢菌克隆到參與西索米星生物合成的又一新基因。該基因在GenBank的接受號為DQ250992。基因silD的克隆和表達為進一步研究其生物學功能奠定了基礎。

作者：洪文榮 曾誌紅 朱春寶 陳代傑 朱寶泉《中國抗生素雜誌》

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