兩種氟喹諾酮類藥物對肺炎克雷伯菌防耐藥突變濃度及耐藥突變體耐藥性的研究

【摘要】  目的 測定兩種氟喹諾酮類藥物(FQNs)對肺炎克雷伯菌(KP)的防耐藥突變濃度(MPC)，比較其防耐藥突變能力，了解突變耐藥菌對FQNs的耐藥性。方法 肉湯法富集1010CFU/ml的菌液接種於不同濃度環丙沙星及加替沙星瓊脂平皿上，采用瓊脂二倍稀釋法測定環丙沙星、加替沙星對臨床分離肺炎克雷伯菌ATCC700603及其耐藥突變體的最低抑菌濃度(MIC)、防耐藥突變濃度(MPC)。對不同藥物濃度篩選出的耐藥突變株進行編碼拓撲異構酶VIC亞單位基因parC和回旋酶A亞單位基因gyrA喹諾酮耐藥決定區的PCR擴增和測序，並測定外排泵抑製劑羥基氰氯苯腙(Carbonyl Cyanide mchlorophenylhydrazone，CCCP)對環丙沙星和加替沙星MIC的影響。結果 環丙沙星、加替沙星對ATCC700603的MPC分別為4、1.6mg/L，細菌耐藥選擇指數分別為16、4。兩種藥物的耐藥突變體均出現了gyrA的第83位(TCC→ATC/TTG)均出現了突變，引起了相應氨基酸的改變(Ser83→Ile/Leu)。其中有一株同時也出現了第87位點(GAC→AAC)的改變，氨基酸也由Asp→Asn。除第二步突變體parC第80位點突變(AGC→ATC)，引起氨基酸由Ser→Ile的改變外，其餘幾株均沒有發生parC的突變。MIC測定結果顯示，單用兩種FQNs及合用CCCP的結果一樣。結論 加替沙星限製KP耐藥突變株選擇的能力強於環丙沙星，KP的耐藥突變株對FQNs耐藥的主要原因是gyrA和parC基因突變。

【關鍵詞】  氟喹諾酮； 肺炎克雷伯菌； 耐藥； 防耐藥突變濃度

    ABSTRACT  Objective  To determine mutant prevention concentration (MPC) of two fluoroquinolones for Klebsiella pneumoniae (KP) and compare the capacity of fluoroquinolones to prevent the resistant mutant strains.  Methods  The KP strain ATCC700603 was enriched in broth, and the bacterial concentrations were adjusted to 1010 colony forming units per milliliter. The minimal inhibitory concentration (MIC) and MPC of gatifloxacin and ciprofloxacin for KP were determined by agar plates dilution method. Quinolone resistancedeternining region (QRDR) of parC and gyrA genes were identified by PCR amplification and gene sequencing. The effect of effluxpump inhibitor CCCP on MICs of gatifloxacin and ciprofloxacin for resistant mutants was determided by agar dilution method.  Results  The MPC of gatifloxacin and ciprofloxacin for KP strain ATCC700603 were 1.6 and 4mg/L, and the MPC/MIC were 4 and 16 respectively. The all strains had an TCC→ATC or TCC→TTG mutation in codon 83, leading to amino acid change: Ser→Leu or Ser→Ile. At the same time, a GAC→AAC mutation was found in codon 87 which resulted in amino acid change: Asp→Asn. Except for the secondstep mutant, DNA sequencing analysis of parC did not reveal point mutation (AGC→ATC) leading the substitution of a Ile for Ser in 4 strains. As for the MICs, of which the two fluoroquinolones withCCCP were same as the MICs without CCCP.  Conclusions  The capacity of gatifloxacin for restricting the selection of KP resistant mutants is stronger than that of ciprofloxacin. The mutation of gyrA and parC genes are the primary mechanisms responsing for resistance of Klebsiela pneumoniae to FQNs.

    KEY WORDS  Fluoroquinolones;  Klebsiella pneunoniae;  Drug resistance;  Mutant prevention concentration

    肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneunoniae，KP)是兼性厭氧的革蘭陰性菌，通常存在於人類腸道及呼吸道，是目前重要的條件致病菌，其發病率［1］僅次於大腸埃希菌和銅綠假單胞菌。氟喹諾酮類藥物(FQNs)是治療KP感染的常用藥，由於其廣泛應用，KP對其耐藥性逐年遞增。目前，就新一代FQNs的耐藥性及延長其臨床使用壽命，國外學者Drlica提出了防耐藥突變濃度(mutant prevention concentration，MPC)這一概念［2］，該理論在關注抗菌藥物預防細菌耐藥變異的同時，對臨床醫師的用藥也起到了重要的作用。關於MPC的研究國內已經開始，但尚未見對KP的報道。本實驗測定了環丙沙星(CPLX)和加替沙星(GTLX)對KP的防耐藥突變濃度及耐藥突變株對二者的敏感性，以期為臨床合理應用FQNs藥物提供參考。

    1  材料

    1.1  菌株

    受試菌15株，肺炎克雷伯菌ATCC700603(本實驗室保存)，14株臨床分離菌分別來自華西一附院、四川省二院、宜賓市第一人民醫院2006年6月～8月臨床分離的對環丙沙星敏感菌。

    1.2  抗菌藥物

    環丙沙星(CPLX廣州南新製藥有限公司，批號CFI02706)、加替沙星(GTLX浙江亞太藥業股份有限公司，批號060206)和羥基氰氯苯腙(Carbonyl Cyanide mchlorophenylhydrazone，CCCP，美國Sigma公司)。

    1.3  試劑及儀器

    MullerHinton(MH)肉湯、MH瓊脂、LB肉湯(杭州天和微生物試劑有限公司)。Taq酶和dNTP(大連寶生物工程有限公司)；DNA純化試劑盒(北京天為時代)；SDS、EDTA、飽和酚、氯仿、Tris、EB、瓊脂糖(博瑞克生物科技有限公司)、高速台式離心機(美國Sigma公司)、DYY6B型穩壓穩流電泳儀(北京市六一儀器廠)、PCR擴增議(eppendorf)、凝膠成像議(冷泉港生物科技有限公司)。

    2  方法

    2.1  MIC測定及兩種FQNs藥物聯合CCCP對耐藥突變株的MIC測定

    參照文獻［3］推薦的瓊脂二倍稀釋法測定CPLX和GTLX對臨床分離KP、ATCC700603及不同耐藥突變株的MIC，在測定MIC的同時，製備含有泵抑製劑CCCP的平板(CCCP終濃度為20mg/L)，與CCCP聯用的FQNs的MIC比單用FQNs的MIC降低4倍說明有主動外排機製存在，用大腸埃希S菌ATCC25922作為質控菌。判斷按照參考文獻［3］標準。

    2.2  防耐藥突變濃度(MPC)的測定

    將CPLX和GTLX倍比稀釋成不同的濃度，藥液和MH瓊脂培養基按1∶9的比例在90mm的平板中混勻，配製成濃度高於MIC的係列濃度二倍稀釋的含藥平板，每個濃度4個平板，置37℃孵箱過夜。菌液製備參照文獻Zhao［4］的方法，單個菌落過夜培養後集菌，把菌液調至1010CFU/ml，取100μl均勻地塗在製備好的含藥平板上，孵育24、48和72h後觀察結果，以不出現細菌生長的最低藥物濃度為該藥對這種細菌的MPC值。

    2.3  菌落恢複生長比率曲線的繪製

    按照2.2集菌方法集菌後，將1010CFU/ml的菌液倍比稀釋成不同濃度至103CFU/ml，將不同濃度菌液100μl塗在含抗菌藥物平板上，計數恢複生長菌落數及恢複生長比率，描繪生長比率曲線。

    2.4  GTLX和CPLX對ATCC700603耐藥突變株的選擇及其基因組DNA的提取

    按照上述2.2方法集菌後，將100μl的菌液接種於含2MIC～MPC不同濃度的抗菌藥物平皿上，37℃培養48～72h，挑取不同濃度平板上生長的菌落，將這些菌落培養2代後接種於原藥物濃度的平板上如仍然生長即為耐藥突變株，1、2步耐藥突變株均按照此方法選擇。篩選出的耐藥突變株用堿裂解法提取基因組DNA，做為PCR的DNA模板。

    2.5  耐藥突變株gyrA基因和parC基因的擴增及測序

    使用Primer 5.0設計引物，gyrA正向引物為5′TGCGAGAGAAATTACACC3′，反向引物為5′AATATGTTCCATCAGCCC3′擴增片段長度為625bp；parC：正向引物為5′CCAGCGTCGCATCGTCTA3′，反向引物為5′AAAGTTTGGCACCCAGTCG3′，擴增片段長度為319bp。擴增條件：反應體係為50μl，94℃預變性3min，循環參數為變性94℃ 30s，退火gyrA為50℃ 30s，parC為54℃ 30s，延伸gyrA為72℃ 30s，parC為72℃ 30s，35個循環，72℃延伸10min。擴增產物經含EB的1%瓊脂糖凝膠電泳後照像(圖1)。PCR產物按照產物純化試劑盒純化後委托上海英駿公司測序。

    3.1  GTLX和CPLX對KP臨床分離株、ATCC700603及其耐藥突變體的MPC、MIC

    兩種藥物對ATCC700603的MIC值：GTLX

    N：空白對照；  M：DNAmarker；

    1～6：分別為耐藥突變體gyrA、parC基因擴增產物

    圖1    gyrA基因擴增產物電泳圖(0.4μg/ml)>CPLX(0.25μg/ml)，MPC值：CPLX(8μg/ml)>GLXT(1.6μg/ml)，選擇指數(MPC/MIC)：GTLX(4)<CPLX(32)，結果見表1。GTLX和CPLX對ATCC700603選擇出的第一步耐藥突變體的MIC值較同濃度下ATCC700603的MIC值分別升高5、24倍，第二步又較第一步分別升高了3、5.3倍，結果見表2。兩種FQNS藥物聯合CCCP對耐藥突變株的MIC與單用FQNS的結果相同。< p>

    3.2  GLXT和CPLX對臨床分離株的MPC及MIC值

    90%菌株的MIC顯示GTLX的MIC值大於CPLX，MPC值小於CPLX，選擇指數為GTLX< MIC值分別運用獨立樣本T檢驗P

    3.3  兩種FQNs對KP標準菌的菌落恢複生長比率曲線

    隨著FQNs藥物濃度逐漸增加，細菌恢複生長的菌落數出現兩次明顯下降。第1次下降發生在MIC99；隨著藥物濃度增加，恢複生長的菌落數逐漸減少並維表1        GTLX和CPLX對臨床分離KP及ATCC700603的MIC、MPC(μg/ml)表2    GTLX和CPLX對ATCC700603的耐藥 ATCC700603的第一步耐藥突變體和第二步突變體。持在相對穩定的水平(平台期)，藥物濃度進一步增加，菌落數出現第2次明顯下降，直至藥物濃度增高到MPC時瓊脂平板中沒有菌落生長，由圖可見GTLX的平台期明顯比CPLX的短，見圖2。

    3.4  PCR結果

    對CPLX和GTLX的耐藥突變菌株的gyrA和parC基因進行擴增，經含EB的1%瓊脂糖凝膠電泳照相(圖1、圖3)，不同濃度下的耐藥突變菌均擴增出了600和300bp左右的片段產物，N為空白對照，無條帶。 GTLX和CPLX的耐藥突變株gyrA均出現了堿基的突變，其中第83位氨基酸的密碼子發生了由TCC→ATC或TCC→TTG的改變，導致編碼的氨基酸出現相應的改變，由Ser83→ILE或Ser83→LEU，其中CPLX的第二步突變體還發生了87氨基酸的密碼子改變，GAC→AAC，相應的氨基酸也由Asp87→Asn。除CPLX第二步突變體的parC發生了堿基的突變外其餘均未突變，80位氨基酸的密碼子由AGC→ATC，相應的氨基酸由Ser80→Ile。結果見表3。表3    耐藥突變株的gyrA和parC的突變位點及氨基酸的變化

　　4  討論

    近年來由於FQNs藥物在臨床及其他領域廣泛應用，KP對FQNs類藥物耐藥日益嚴重。研究FQNs的耐藥機製，對臨床用藥、延長藥物使用壽命及新藥的開發有重要意義。

    國外學者研究［2，5，6］表明，細菌對FQNs是濃度累積性的，隨著瓊脂平板中FQNs藥物濃度的增加，恢複生長的菌落數出現兩次明顯下降，第一次下降是在MIC99時，隨著藥物濃度的增加，能夠恢複生長的菌落數逐漸減少，直至維持在相對穩定的水平即平台期，藥物濃度進一步增加，菌落數出現第二次下降，直至藥物濃度增高到某一限度時瓊脂平板中沒有菌落生長，該藥物濃度就是防耐藥突變體選擇濃度(MPC)。MPC是指防止突變菌株選擇性擴增的一個閾值［7］，MPC與MIC的比值為選擇指數，MPC和MIC之間的濃度範圍為選擇突變窗(MSW)［8］。不同藥物對相同細菌的MPC和MIC值不同，MPC值小、MPC/MIC值小、MSW窄，預防耐藥突變的能力越強。本實驗測定了CPLX和GTLX對臨床分離的KP、ATCC700603及其耐藥突變體的MIC、MPC及MPC/MIC值。對於ATCC700603，從細菌恢複生長曲線可見，GTLX的平台期較短而CPLX的平台期較長，也就是說GTLX的MSW較CPLX的窄，突變菌株不容易富集擴增，出現耐藥的機會就少，這和文獻［9］相符合；從MPC結果來看，MPC加替沙星< MIC)，GTLX

    KP對FQNs耐藥的主要機製是靶位改變和主動外排增強，KP的靶位改變主要集中在編碼GyrA(gyrA和gyrB)和編碼拓撲異構酶Ⅳ(ParC和ParE)上，對革蘭陰性菌，靶位改變主要集中在GyrA上［12］。本實驗研究GTLX和CPLX的耐藥突變體在單用及合用CCCP的MIC值沒有改變，但GyrA亞基均出現了83位氨基酸的突變，由極性氨基酸變為非極性氨基酸，使該位點的親水性降低，FQNs藥物與DNA回旋酶的親和力下降，表現為對藥物的耐藥，也表明了83位氨基酸改變是此實驗中導致KP耐藥的主要原因，這與文獻［13］報道基本一致。CPLX的第二步耐藥突變體同時還出現了gyrA 87位氨基酸和parC的80位氨基酸的改變，表明FQNs篩選出的耐藥突變體主要是靶位改變，多步耐藥突變跟gyrA和parC雙突變有關［14］。

    綜上所述，臨床上對於KP感染的治療策略不應該僅僅著眼於控製感染，在達到控製感染的同時還應該考慮到限製耐藥突變株的選擇性擴增，阻斷第一步突變株的富集，減少耐藥菌的出現。本實驗顯示GTLX限製KP耐藥突變株的能力強於CPLX，因此治療KP感染時，不僅要掌握這兩種藥物的結構和藥效特點，而且還要靈活的改變治療方案，控製感染的同時達到防止耐藥菌的生長。

本實驗僅從KP的體外試驗進行測定MPC值，至於其在體內的MPC值及兩種FQNs藥物體內藥物代謝動力學，以及FQNs對KP的MPC值與血藥濃度的關係，有待進一步研究，如果MPC理論能夠通過動物體內試驗或人體試驗的深入和驗證，將會對臨床用藥方案和藥效與評價產生重大影響，並為解決日益嚴峻的臨床耐藥問題提供新的思路和方法。

 作者：鄧曉慧鄭風勁 何文富 孫愛慧 劉小康《中國抗生素雜誌》

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