大環內酯類藥物治療銅綠假單胞菌慢性感染機製的研究進展

【摘要】  近年來大量研究表明長期應用大環內酯類藥物或大環內酯類藥物與其它抗生素聯用均能有效控製銅綠假單胞菌所致的慢性感染。大環內酯類在治療銅綠假單胞菌慢性感染方麵主要具有：①抑製銅綠假單胞菌藻酸鹽和表多糖的產生；②影響銅綠假單胞菌III型分泌係統，減少毒力因子的產生；③破壞銅綠假單胞菌表麵結構，抑製細菌對宿主的黏附；④抑製細菌QS係統，減少自身信號誘導分子的合成；⑤增加炎症細胞聚集，減少炎性細胞凋亡，對抗機體的炎症反應；⑥增加呼吸道痰液的清除，降低痰液粘稠度；⑦對銅綠假單胞菌具有暴露時間依從性殺菌活性等方麵的功能，能最終達到對銅綠假單胞菌慢性感染的有效控製。

【關鍵詞】  大環內酯類； 銅綠假單胞菌； 感染

    ABSTRACT  Recent years, plenty of experiments have demonstrated that longterm use of macrolide or combined with other antibiotics therapy in chronic Pseudomonas aeruginosa infections have had positive results.The mechanisms of macrolides to chronic Pseudomonas aeruginosa infections is likely attributable to seven predominant effects: ① inhibition of production of Pseudomonas aeruginosa alginate and exopolysaccharide; ②modulation of bacterial type III secretion,reduction of bacterial virulence factors; ③impairing bacterial cell surface structures and surpressing adherence to host cells; ④inhibition of quorum sensing in Pseudomonas aeruginosa, reduction of quorumsensing signal molecule synthesis; ⑤increasing inflammatory cell collection, reduction of inflammatory cell apoptosis; ⑥suppressing sputum production, decreasing viscosity and improving sputum clearance, and ⑦exposuring timedependent killing Pseudomonas aeruginosa acticity.

    KEY WORDS  Macrolide;  Pseudomonas aeruginosa;  Infection

   1  大環內酯類藥物對銅綠假單胞菌藻酸鹽和表多糖的影響

    生物膜的形成是一個動態的過程，包括細菌黏附、微菌落的形成和細胞外多聚基質的包裹等三個過程。細胞外多聚糖是生物膜的主要組成部分，也是細菌耐藥的重要原因，藻酸鹽是黏液性銅綠假單胞菌生物膜多糖的主要成分，表多糖是非黏液性銅綠假單胞菌生物膜的主要成分。14、15元環大環內酯類對銅綠假單胞菌藻酸鹽具有明顯抑製作用，14元環大環內酯類克拉黴素和琥乙紅黴素使生物膜中多糖、蛋白質和藻酸鹽水平下降並呈劑量依從關係，當克拉黴素和琥乙紅黴素的藥物濃度不小於10mg/ml時多糖、蛋白質和藻酸鹽水平均有顯著下降，且兩者抑製作用無顯著差異［1］。琥乙紅黴素、克拉黴素和羅紅黴素對黏液株生物膜的作用強於非黏液株，阿奇黴素對銅綠假單胞菌生物膜的作用最強，大於或等於1/156最低抑菌濃度(MIC)的阿奇黴素對黏液型銅綠假單胞菌藻酸的產生具有明顯的抑製作用，在大於或等於1/16 MIC時對非黏液型銅綠假單胞菌生物膜具有明顯抑製作用［2］。14、15元環大環內酯類對藻酸鹽的抑製作用主要是通過對藻酸鹽合成限速酶鳥苷二磷酸D甘露糖脫氫酶酶活性的抑製作用實現的，而16元環大環內酯類則不具此作用，它們的有效作用位點是5位上的糖鏈結構［3］。

    2  大環內酯類藥物對銅綠假單胞菌III型分泌係統的影響

    III型分泌係統包括毒素、色素和表多糖等，它們是銅綠假單胞菌主要毒力因子。銅綠假單胞菌能夠分泌多種細胞外毒素，它們能通過對細胞組織的破壞、炎症和對其它局部和全身影響而構成感染發病學。有研究報告用濃度超過0.1～10μg/ml的琥乙紅黴素對生長中的細菌作用24h後，雖然對細菌無顯著殺滅作用，但是仍能抑製細菌產生彈性酶、蛋白酶和白介素［4］；在另一研究中更進一步證實了濃度為0.125～64μg/ml的琥乙紅黴素能夠完全抑製彈性酶的產生［5］，阿奇黴素、琥乙紅黴素、羅紅黴素和羅他黴素一樣能抑製銅綠假單胞菌胞外酶和外毒素A，並且阿奇黴素在抑製彈性酶、蛋白酶、卵磷脂酶和脫氧核糖核酸酶的作用方麵明顯強於其它大環內酯類抗生素，阿奇黴素抑製α脫氧核糖核酸酶的作用亦明顯強於琥乙紅黴素。琥乙紅黴素、克拉黴素和阿奇黴素能抑製綠膿菌素的產生，而羅他黴素、阿波黴素、交沙黴素和竹桃黴素則不具此作用［6，7］。另外在體外實驗中證實琥乙紅黴素能抑製銅綠假單胞菌D4所產生的外毒素A、全部蛋白酶、彈性酶和磷脂酶C，並存在劑量依從關係［8］。

    3  大環內酯類抗生素對銅綠假單胞菌表麵結構和細菌對宿主黏附性的影響

    細菌表麵結構包括菌毛、纖毛和鞭毛。銅綠假單胞菌生物膜形成首先要求細菌黏附於宿主黏膜細胞或者是上皮細胞上，最初黏附是由細菌表麵結構菌毛和纖毛穿過黏液層與相應的宿主受體相結合而實現的。有研究證明采用1/4 MIC的琥乙紅黴素僅4h就可顯著減少纖毛的數量以及纖毛的黏附［9］。鞭毛能幫助細菌運動到適宜的環境下並產生黏附形成菌落。大環內酯類能在低於最低抑菌濃度下能抑製鞭毛蛋白的表達，有研究報道琥乙紅黴素、克拉黴素以及阿奇黴素在低於最低抑菌濃度下能抑製銅綠假單胞菌的運動，而阿奇黴素在1/8最低抑菌濃度時對鞭毛蛋白的抑製作用優於琥乙紅黴素和克拉黴素［10］。某些特定的大環內酯類抗生素能改變細胞表麵結構，例如脂多糖和外膜蛋白，進而增加該細菌對抗菌藥物的敏感性，琥乙紅黴素減少脂多糖的作用可以通過檢測脂多糖的一個保守蛋白來定量測定，同時琥乙紅黴素和克拉黴素還通過減少38KDa蛋白和相伴隨的增加41KDa蛋白而使銅綠假單胞菌對血清殺菌活性更加敏感［11］。

    4  大環內酯類抗生素對銅綠假單胞菌QS係統(專屬傳感係統)的影響

    4.1  QS係統與銅綠假單胞菌感染之間的關係

    在銅綠假單胞菌中QS係統決定著細菌主要毒力因子的產生和表達，QS係統在細菌的發病學和毒力基因表達的調控中起著重要作用。銅綠假單胞菌具有兩個QS係統：las和rhl，其中3oxoC12HSL(含氧十二烷酰高絲氨酸內酯)和C4HSL(丁酰高絲氨酸內酯)是QS係統中的自身信號誘導分子，在慢性銅綠假單胞菌感染患者的痰中能夠穩定的檢測出自身信號誘導分子3oxoC12HSL和C4HSL［12］。III型分泌係統是銅綠假單胞菌的主要毒力決定因子，而III型分泌係統基因pD(分泌操縱子)、pS pT pY pG(易位操縱子)和pN(插入操縱子)都受RhlRC4HSL的負性調控［13］，細菌纖毛依賴的振顫活動以及細菌細胞外毒素(彈力酶、堿性蛋白和外毒素A)、鼠李糖脂和綠膿菌素的產生與表達都依賴QS係統，另外銅綠假單胞菌對支氣管上皮細胞的黏附能力有賴於Rhl係統的存在，並且QS係統在生物膜的分化與成熟中也起著至關重要的作用［14］。

    QS係統在銅綠假單胞菌感染時能調節宿主炎症反應。3oxoC12HSL在一定條件下可以成為免疫抑製劑，實驗表明它能夠抑製脂多糖活化鼠腹膜腔滲出細胞和人類外周血單核細胞產生白介素12和腫瘤壞死因子，當其濃度達到12μmol/L時則能夠誘導巨噬細胞和中性粒細胞的凋亡［16～18］。但是3oxoC12HSL又是多形核細胞的有效刺激因子，並且能夠刺激人類支氣管上皮細胞產生炎症趨化因子白介素8，它還能在體內通過誘導多種炎症趨化因子和化學增活劑而產生一係列複雜的反應，並導致機體的損傷［19］。

    4.2  大環內酯類藥物對QS係統的作用

    大環內酯類藥物對QS係統的抑製是通過有效抑製QS係統中自身誘導分子的合成來達到對銅綠假單胞菌感染的控製和改變病原體驅動的宿主免疫應答的，如白介素8的產生和中性粒細胞的凋亡。研究表明在對銅綠假單胞菌PAO1的實驗中，2μg的阿奇黴素能顯著抑製80% lasI和50% rhlI的轉錄［20］，能將3oxoC12HSL和C4HSL的產生分別降至隻相當於對照組的6%和28%的水平，並且阿奇黴素對細菌的這些影響在自然界是具有一定選擇性的，琥乙紅黴素、克拉黴素和羅紅黴素能抑製lasI基因的表達，而竹桃黴素和交沙黴素則不具此功能［21］。

    5.1  銅綠假單胞菌感染對機體免疫反應的抑製

    用光化學反應的方法檢測發現相對於遊離型銅綠假單胞菌，黏液株和非黏液株生物膜中多形核白細胞數量均顯著下降。研究表明黏液株生物膜主要構成成分藻酸鹽能阻礙多形核白細胞趨化和吞噬細菌作用，當藻酸鹽被酶分解後對多形核白細胞對黏液株的吞噬作用增強，非黏液株生物膜中多形核白細胞數量也減少，破壞生物膜後數量增加［22］。當自身信號誘導分子3oxoC12HSL達到一定濃度是則可誘導巨噬細胞和中性粒細胞的凋亡，導致機體對細菌的清除能力進一步降低。

    5.2  大環內酯類藥物對機體免疫反應的影響

    大環內酯類藥物能抑製藻酸鹽和表多糖的生成，因此能夠抑製黏液株和非黏液株銅綠假單胞菌生物膜形成［22］，並且特定的大環內酯類藥物還能夠抑製QS係統以及其自身信號誘導分子3oxoC12HSL，阻斷3oxoC12HSL誘導的巨噬細胞和中性粒細胞的凋亡［16］，增強細胞對細菌的吞噬和殺傷能力。低於最低抑菌濃度的大環內酯類藥物能夠使黏液型和非黏液型銅綠假單胞菌生物膜中多形核白細胞數量顯著增加，促進多形核白細胞清除細菌，而對遊離型銅綠假單胞菌中多形核白細胞影響不大［22］。

    相當數量的證據也顯示有幾種大環內酯類藥物能夠影響吞噬細胞的功能［23～27］，能影響多形核細胞功能的大環內酯類藥物的濃度明顯高於它們各自所能達到的血清學濃度，但是一旦琥乙紅黴素被活躍的轉運至多形核白細胞處，它們在細胞內的濃度就能達到細胞外濃度的若幹倍［28］；阿奇黴素在多形核白細胞、肺泡巨噬細胞和成纖維細胞中的濃度高於細胞外環境中濃度的100多倍［29］。但是使用用大環內酯類藥物預處理過的多形核白細胞作用銅綠假單胞菌與未處理過的多形核白細胞作用對照卻無顯著差異。通過大環內酯類藥物作用生物膜和周圍細菌來提高多形核白細胞吞噬黏液型和非黏液型銅綠假單胞菌的能力，優於直接使用多形核白細胞本身的治療效果［22］。

    6  大環內酯類藥物的抗炎活性

    琥乙紅黴素在沒有其它抗生素的前提下能夠阻斷銅綠假單胞菌感染時炎症細胞因子的產生［30］。CXCL8(多形核白細胞趨化因子)在肺囊性纖維變的發病學中具有重要意義，綠膿菌素通過氧化應激而刺激該因子的產生，阿奇黴素通過抑製綠膿菌素來達到對CXCL8表達的抑製作用。羅紅黴素可以通過取代NFκb(核因子κB)與AP1(激活蛋白因子1)結合來減少炎症因子的表達，它能夠抑製由各種內毒素刺激巨噬細胞所產生的白介素8，並具有劑量依從性［31，32］。大環內酯類藥物抗炎反應活性還與調節中性粒細胞的活動有關，它們可以減少中性粒細胞的凋亡，阿奇黴素不但可以減少中性粒細胞的凋亡還可下調中性粒細胞的氧爆發活動［33］。琥乙紅黴素可以抑製人類中性粒細胞彈性蛋白酶活性從而減輕組織的損傷，但是它同時又能激活白介素8的產生。有實驗證明每天使用250mg阿奇黴素並連續使用3個月後患者C反應蛋白顯著下降［34］。

    7  大環內酯類藥物對呼吸道痰的粘稠性和清除率的影響

    大環內酯類藥物可以抑製痰液的產生，降低其粘稠度和促進其清除，其中羅紅黴素和阿奇黴素都具有明顯療效，但是琥乙紅黴素則不具顯著療效，其中阿奇黴素尚存在著劑量依從性關係［31］。

    8  大環內酯類藥物的暴露時間依從性殺菌活性

    基於傳統的抗微生物實驗操作，大環內酯類藥物不展現固有的抗銅綠假單胞菌活性，但是在與其它抗生素聯合使用治療多重耐藥菌時卻可觀察到附加和協同作用。大環內酯類藥物長期潛伏在細菌內可以降低銅綠假單胞菌的生存能力［35］，用阿奇黴素作用48h或采取劑量依從方式可明顯降低銅綠假單胞菌PAO1的生存能力，但是時間小於24h或濃度過h影響不明顯，隻有特定的大環內酯類具有這種時間依從性，如：琥乙紅黴素、克拉黴素和阿奇黴素，而其它大環內酯類藥物則不具有此特點。這種細菌生存能力的減退是與細菌蛋白合成下降相聯係的，而細菌蛋白合成的下降又與細菌內時間依從性抗生素的蓄積有關。更有甚者，大環內酯類藥物蓄積可導致細菌應激反應，這些抗生素可導致主要的應激蛋白發生改變，導致細菌生存能力的下降［36］。大環內酯類藥物的暴露時間依從性殺菌活性也說明了為何起臨床療效的大環內酯類藥物的劑量與實驗室的最低抑菌濃度評估之間存在差異。

對銅綠假單胞菌所致的慢性感染人們做了大量的研究和探索，通過研究藥物對慢性感染中銅綠假單胞菌作用機製的研究，有助於發現針對銅綠假單胞菌慢性感染的有效治療方法，以期在未來的研究中能夠發現或研製出更加有效的藥物、更好的給藥方式和更加適宜的聯合用藥方案來達到對銅綠假單胞菌慢性感染的有效控製。

作者：萬珍豔 餘加林《中國抗生素雜誌》

  ［1］ Kondoh K, Hashiba M. Inhibitory effect of macrolide antibiotics on biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa ［J］. Nippon Jibiinkoka Gakkai Kaiho,1998,101(1):25～36.

［2］ Ichimiya T, Takeoka K. The influence of azithromycin on the biofilm formation of Pseudomonas aeruginosa in vitro ［J］. Chemotherapy,1996,42(3):186～189.

［3］ Nagino K, Kobayashi H. Influence of macrolides on mucoid alginate biosynthetic enzyme from Pseudomonas aeruginosa ［J］. Clin microbiol Infect,1997,3(4):432～439.

［4］ Kita E, Sawaki M, Ku D, et al. Suppression of virulence factors of Pseudomonas aeruginosa by erythromycin ［J］. Antimicrob Chemother,1991,27(3):273～284.

［5］ Sakata K, Yajima H, Tanaka K, et al. Erythromycin inhibits the production of elastase by Pseudomonas aeruginosa with affecting its proliferation in vitro ［J］. Am Rev Respir Dis,1993,148(49+1):1061～1065.

［6］ Molinari G, Paglia P, Schito G C. Inhibition of motility of Pseudomonas aeruginosa and Proteus mirabilis by subinhibitory concentrations of azithromycin ［J］. Clin Microbiol Infect Dis,1992,11(5):469～471.

［7］ Molinari G, Guzman C A, Pesce A, et al. Inhibition of Pseudomonas aeruginosa virulence factors by subinhibitory concentrations of azithromycin and.

［8］ Hirakata Y, Kaku M, Mizukane R, et al. Potential effects of erythromycin on host defense systems and virulence of Pseudomonas aeruginosa ［J］. Antimicrob Agents Chemother,1992,36(9):1922～1927.

［9］ Yamasaki T, Ichimiya T, Hirai K, et al. Effect of antimicrobial agents on the piliation of Pseudomonas aeruginosa and adherence to monse tracheal epithelium ［J］. Chemother,1997,9(1):32～37.

［10］ Kawamura, Sato K, Hasegawa T, et al.Effect of subinhibitory concentrations of macrolides on expression of flagellin in Pseudomonas aeruginosa and Proteus mirabilis ［J］. Antimicrob Agents Chemother,2002,44(10):2869～2872.

［11］ Tateda K, Hirakata Y, Furuya N, et al. Effect of subMICS of erythromycin and other macrolide antibiotics on serum sensitivity of Pseudomonas aeruginosa ［J］. Antimicrob Agents Chemother,1993,37(4):675～680.

［12］ Erickson D L, Endersby R, Kirkham A, et al. Pseudomonas aeruginosa quorumsensing systems may control virulence factor expression in the lungs of patients with cystic fibrosis ［J］. Infect Immun,2002,70(4):1783～1790.

［13］ Sophie Bleves, Chantal Soscia. Quorum sensing negatively controls type III secretion regulon expression in Pserudomonas aeruginosa PAO1 ［J］. Bacteriology,2005,187(11):3898～3902.

［14］ Glessner A, Smith R S, Iglewski B H, et al. Role of Pseudomonas aeruginosa las and rhl quorumsensing systems in control of twitching motitity ［J］. Bacteriol,1999,181(5):1623～1629.

［15］ Yusuf Nalca, Lothar Jnsch. Quorumsensing antagonistic activities of azithromycin in Pseudomonas aeruginosa PAO1: a global approach ［J］. Antimicrob Agents Chemother,2006,50(5):1680～1688.

［16］ Telford G, Wheeler D, Williams P, et al. The Pseudomonas aeruginosa quorumsensing signal molecule N(3oxododecanoyl)Lhomoserine lactone has immunomodulatory activity ［J］. Infect Immun,1998,66(1):36～42.

［17］ Chhabra S R, Harty C, Hooi D S, et al. Synthetic analogues of the bacterial signal (quorum sensing) molecule N(3oxododecanoyl)lhomoserine lactone as immune modulators ［J］. Med Chen,2003,46(1):97～104.

［18］ Tateda K, Ishii Y, Horikawa M, et al. The Pseudomonas aeruginosa autoinducer N3oxododecanoyl homoserine lactone ［J］. Infect Immun,2003,71(10):5785～9573.

［19］ Dimango E, Zar H J, Bryan R, et al. Diverse Pseudomonas aeruginosa gene products stimulate respithelial cell to products stimulate respithelial cell to produce interleukin8 ［J］. Clin Invest,1995,96(5):2204～2210.

［20］ Tateda K, Comte R, Pechere J C, et al. Azithromycin inhibits quorum sensing in Pseudomonas aeruginosa ［J］. Antimicrob Agents Chemother,2001,45(6):1930～1933.

［21］ Kazuhiro Tateda, Keizo Yamaguchi. Regulatory effects of macrolides on bacterial virulence: Potention role as quoruumsensing inhibitors ［J］. Curr Pharmaceut Design,2004,10:3055～3065.

［22］ Takeoka K, Ichimiya T, Yamasaki T, et al. The in vitro effect of macrolides on the interaction of human polymorphonuclear leukocytes with Pseudomonas aeruginosa in biofilm ［J］. Chemotherapy,1998,44(3):190～197.

［23］ Ras G J, Anderson R, Taylor G W, et al. Clindamycin, erythromycin, and roxithromycin inhibit the proinflammatory interaction of Pseudomonas aeruginosa pigments with human neuthophils in vitro ［J］. Antimicrob Agents Chemother,1992,36:1236～1240.

［24］ Anderson R. Erythromycin and roxithromycin protentiate human neutrophil locomotion in vitro by inhibition of leukoattractantactivatedsuperoxide generation ［J］. Infect Dis,1989,159:966～973.

［25］ Nancy B, Esterly M D, Nancy L, et al. The effect of antimicrobial agents on leukocyte chemotaxis ［J］. Invest Dermatol,1978,70:51～55.

［26］ Miyaachi Y, Yoshida A, Imamura S, et al. Effect of antibiotics on the generation of reactive oxygen species ［J］. Invest Dermatol,1986,86:449～453.

［27］ Fietta A, Bersani C, Santagada T, et al. In vitro activity of macrolides on human phagocytic functions ［J］. Chemioterapia,1987,6:52～56.

［28］ Ball A P. Azithromycin in the treatment of lower respiratory tract infection ［J］. Rev Contemp Pharmacother,1994,5:351～357.

［29］ Carlier M B, Zenebergh A, Tulkens P M. Cellular uptake and subcellular distribution of roxithromycin and erythromycin in phagocytic cells ［J］. Antimicrob Chemother,1987,20:47～56.

［30］ Schultz M J, Speelman P, Van der Poll T. Erythromycin inhibits Pseudomonas aeruginosainduced tumor necrosis factoralpha production in human whole blood ［J］. Antimicrob Chemother,2001,48:275～278.

［31］ Thao N, Pharml D. Potential role of macrolide antibiotics in the management of cysticfibrosis lung disease ［J］. Cur Opin Pulm Med,2002,8:521～528.

［32］ Kikuchi T, Hagiwarak, Honda Y, et al. Clarithromycin suppressed lipopolysaccharideinduced interleukin8 production by human monocytes through AP1 and NFKB transcription factors ［J］. Antimicrob Chemother,2002,49:745～755.

［33］ Culic O, Erakovic V, Cepelak K. Azithromycin and resting host defense mechanisms in healthy human subjects ［abstract］ ICMASKO 6,2002,Bologna:6.1.

［34］ Wolter J, Seenery S, Bell S, et al. Effect of long term treatment with azithromycin on disease parameters in cystic fibrosis: A randomized trial ［J］. Thorax,2002,57:212～216.

［35］ Tateda K, Ishii Y, Matsumoto T, et al. Direct evidence for antipseudomonal activity of macrolides: exposuredependent bactericidal activity and inhibition of protein synthesis by erythromycin, clarithromycin, andazithromycin ［J］. Antimicrob Agents Chemother,1996,40(10):2271～2275.