國內9家醫院銅綠假單胞菌消毒劑-磺胺耐藥基因的研究

【摘要】  目的 調查臨床分離銅綠假單胞菌消毒劑-磺胺耐藥基因qacE△1-sulI的存在情況。方法 收集國內9家醫院臨床分離的311株銅綠假單胞菌，采用PCR法檢測qacE△1-sulI基因。結果 311株銅綠假單胞菌196株檢出qacE△1-sulI基因，總檢出率為63.0%。9家醫院銅綠假單胞菌qacE△1-sulI基因檢出率有較大差異。結論 9家醫院臨床分離銅綠假單胞消毒劑-磺胺耐藥基因qacE△1-sulI攜帶率高。

【關鍵詞】  消毒劑； 磺胺； 耐藥基因； 銅綠假單胞菌

    ABSTRACT  Objective  To investigate the distribution of the antiseptic-sulfadiazine-resistance gene qacE△1-sulI in Pseudomonas aeruginosa isolated from nine hospitals in China.  Methods  qacE△1-sulI gene were detected by PCR methods in 311 clinical strains of Pseudomonas aeruginosa collected from the hospitals. Results  196 of 311 isolates were positive for qacE△1-sulI gene (63.0%) and the positive rates were diverse in the hospitals.  Conclusion  The study showed that the positive rate of qacE△1-sulI gene was high and diverse in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa in China.

    KEY WORDS  Antiseptic;  Sulfadiazine;  Resistance gene;  Pseudomonas aeruginosa

     銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)是醫院感染(如肺炎、敗血症、尿路感染、傷口感染等)的最重要的病原菌之一，容易引起醫院感染的暴發和流行。與耐抗菌藥物菌株一樣，耐消毒劑菌株的出現可能將導致醫院消毒的失敗。細菌耐消毒劑主要為獲得qac基因所致。在細菌耐藥機製中I類整合子起著非常重要的作用，它的3′保守端有消毒劑的耐藥基因(qacE△1)和磺胺耐藥基因(sulI)。為了解國內9家醫院PA消毒劑-磺胺耐藥基因qacE△1-sulI的流行現狀，我們對2003年1月～2004年12月從臨床標本中分離到的311株PA進行qacE△1-sulI基因檢測和分析，現報告如下。

    1  材料與方法

    1.1  菌株來源、鑒定

    收集國內部分地區9家醫院臨床分離的PA菌311株，包括江蘇省南京醫科大學附屬無錫第一醫院26株(醫院A)、江南大學附屬醫院無錫市第五人民醫院37株(醫院B)、浙江省湖州解放軍第98醫院30株(醫院C)、浙江省紹興市第二人民醫院39株(醫院D)、麗水市人民醫院40株(醫院E)、蘇州大學附屬第二醫院33株(醫院F)、北京解放軍第304醫院35株(醫院G)、天津市第四醫院36株(醫院H)、湖北省同濟醫學院附屬襄樊醫院35株(醫院I)。標準菌株銅綠假單胞菌ATCC27853購自衛生部臨床檢驗中心。qacE△1基因擴增陽性對照來自PA，由無錫市克隆遺傳技術研究所篩查獲得，並經測序證實。

    1.2  細菌qacE△1-sulI基因的檢測

    (1)PCR模板提取  挑單個菌落少許置入內含50μl裂解液(0.5%非離子去汙劑NP40配製的400μg/ml蛋白酶K)中，置55℃水浴消化1h，改置95℃水浴滅活10min，15000r/min 30s，上清液即為qacE△1-sulI基因PCR模板液。

    (2)PCR引物序列與合成  根據GenBank中已發布的I類整合子基因序列設計引物，I類整合子qacE△1與sulI基因為重疊基因，本研究在qacE△1下遊設計引物P1，在sulI上遊設計引物P2，引物序列如下：P1：5′-TAGCGAGGGCTTTACTAAGC-3′，P2：5′-ATTCAGAATGCCGAACACCG-3′，PCR擴增後陽性產物為300bp。PCR擴增陽性表示qacE△1與sulI基因同時存在。

    (3)PCR擴增體係  每反應體係P1、P2引物各0.5μmol/L，KCl mmol/L，(NH4)2SO4 8mmol/L，MgCl2 2mmol/L，Tris-HCl(pH9.0)10mmol/L，NP40 0.5%，Taq DNA聚合酶1U。總反應體積20μl，其中模板液5μl。熱循環參數均為：93℃預變性2min，然後93℃ 30s→55℃ 30s→72℃60s，共35周期。最後一個循環72℃延伸至5min。產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠(EB)染色，紫外燈下觀察結果，出現與陽性對照分子相當的目的條帶判為陽性，並拍照保存。耐藥基因檢測試劑盒由無錫市克隆遺傳技術研究所提供，純水為陰性對照。

    2  結果

    311株PA中196株檢出qacE△1-sulI基因，陽性率為63.0%。qacE△1-sulI基因PCR電泳圖見圖1。9家醫院PA菌耐消毒劑基因qacE△1-sulI存在狀況見表1，各醫院qacE△1-sulI基因檢出率有較大差異，有的醫院檢出率高達100%。本研究對部分qacE△1-sulI基因PCR陽性產物進行了測序，測得序列一致，與已在美國核酸數據庫(GenBank)中已登錄的qacE△1-sulI基因序列(登錄號U12338)完全相同。

    3  討論

    消毒滅菌是控製醫院感染的重要方法，隨著消毒    M：分子量標記，由上而下分別為50、100、150、200、250、劑廣泛使用，尤其是消毒劑被廣泛引入日常生活和畜、禽、水產等養殖業，消毒劑的過度使用促使細菌產生耐消毒劑現象。細菌對消毒劑的耐藥現象是人類醫學中的一個新問題，尤其在醫院感染的傳播中，對消毒劑的耐藥性可能是重要因素之一。

  早在1951年Lowbury就觀察到了PA對季銨鹽類消毒劑(如潔爾滅、新潔爾滅、度來芬)有耐受現象，之後陸續發現了對雙胍類(如洗必泰)、醛類、酚類、醇類、碘類、含氯消毒劑等的耐受菌株［1］。國內黃忠強等也發現了對消毒劑耐受的PA［2］。細菌耐消毒劑主要為獲得qac基因所致。qac基因表達多種消毒劑化合物外排泵(multidrug efflux pump)蛋白，獲得qac基因可表現為對胺類、胍類、腙類消毒劑耐藥［3］。目前已發現的qac基因家族有qacA、qacB、qacC、qacD、qacE、qacE△1、qacF、qacG、qacH、qacJ等10種［4，5］，其中葡萄球菌易獲得qacA或qacB基因而耐消毒劑，革蘭陰性菌易於獲得qacE△1基因而耐消毒劑［6］。我國也從MRSA中發現qac基因［7］。sulI為二氫蝶酸合成酶的編碼基因，陽性提示細菌對磺胺類藥物耐受。國內顏英俊等［8］報道耐亞胺培南PA菌qacE△1-sulI基因陽性率為41.2%，王家平等［9］報道大腸埃希菌qacE△1-sulI基因陽性率為58.5%，徐衛東等［10］報道產ESBLs肺炎克雷伯菌qacE△1-sulI基因陽性率為37.1%，黃支密等［11］調查了117株臨床分離的革蘭陰性杆菌qacE△1-sulI存在狀況，結果96株陽性，總陽性率為65.3%，其中陰溝腸杆菌、PA菌、鮑氏不動杆菌、嗜麥芽寡養單胞菌和黃杆菌屬細菌qacE△1-sulI基因陽性率分別為85.0%、83.3%、82.5%、10.5%和0，表明耐消毒劑基因廣泛存在於革蘭陰性菌中。本研究結果顯示，國內PA菌qacE△1-sulI基因的攜帶率已達63.0%，且9家醫院qacE△1-sulI基因檢出率有較大差異。PA菌耐消毒劑qacE△1基因極高的攜帶率應引起國內醫院感染控製部門的廣泛重視，而且qacE△1-sulI基因由整合子介導，可被革蘭陽性和革蘭陰性菌廣為獲取［12，13］。

    近年來大量文獻報道，覆有氯已定(雙胍類消毒劑)和磺胺的II代導管能有效預防細菌定植和細菌生物膜形成［14～16］，氯己定浸敷料可降低硬膜外、血管內插管或出口處的細菌定殖危險［17］，但在細菌qacE△1-sulI基因高檢出率的醫療單位其作用需另作評價。正如抗菌藥物濫用導致高耐藥率一樣，細菌耐消毒劑現象也正向我們迫來。由於國內外尚無細菌消毒劑耐藥藥敏試驗的標準出台，消毒劑耐藥基因檢測技術為細菌耐消毒劑的臨床研究、分子流行病學研究提供了快捷手段。

致謝：浙江省湖州解放軍第98醫院黃支密、浙江省紹興市第二人民醫院錢小毛、麗水市人民醫院王偉、蘇州大學附屬第二醫院朱雪明、北京解放軍第304醫院常東、天津市第四醫院付建榮、湖北省同濟醫學院附屬襄樊醫院李智山提供實驗菌株。

 

作者：王春新 王繼東 蔡培泉 過毅 糜祖煌《中國抗生素雜誌》

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