【摘要】 目的 了解嗜麥芽寡養單胞菌的臨床株H407和A26在抗菌藥物誘導下耐藥性和SmeDEF外排泵表達的變化。方法 比較有或無環丙沙星誘導時嗜麥芽寡養單胞菌H407和A26的MIC和EOP值，對在亞抑菌濃度環丙沙星中培育後的菌株smeD基因進行RT-PCR擴增，監測表達水平。結果 對抗生素敏感的H407和A26泵抑製呈陽性或陰性反應。2株菌經環丙沙星過夜孵育後測得的對氯黴素和環丙沙星MIC值比正常非誘導時的MIC值高1～3個稀釋度；加泵抑製劑CCCP後，2個誘導株的MIC值均有明顯下降。H407和A26經環丙沙星誘導後氯黴素的EOP分別有4.8和近4倍的增長。2株菌在抗菌藥物過夜和指數期添加生長時smeD的mRNA明顯高於無抗菌藥物培養株。結論 2株嗜麥芽寡養單胞菌臨床株在環丙沙星誘導下對部分抗菌藥物的耐藥性提高，與SmeDEF泵的誘導表達增加有關。
【關鍵詞】 嗜麥芽寡養單胞菌； 外排泵； 耐藥性； 誘導
ABSTRACT Objective To investigate changes of antibiotic resistance of the clinical isolates of S.maltophilia, and the repression level of efflux pump SmeDEF by the induction of antibiotics. Methods To examine the resistance profile of the clinical strains by agar dilution and the efficiency of plate (EOP) to antimicrobes, and their reactions to pump inhibitor CCCP, and to investigate the mRNA level of smeD by RT-PCR, in the presence or not of ciprofloxacin. Results The antibiotic-sensitive strains H407 and A26 were positive and negative to pump inhibitor respectively. MICs of ciprofloxacin and chloramphenicol induced by ciprofloxacin with sub-inhibition level were higher by 1～3 dilutions than those without induction. The incre-ases were inhibited by CCCP. After induction by ciprofloxacin, the EOP to chloramphenicol in H407 and A26 increased by 4.8 and nearly 4 times respectively, and the level of mRNA of smeD in the 2 antimicrobe-induced strains rose as well. Conclusion The resistance to several antimicrobes in the two isolates of S.maltophilia could be induced by ciprofloxacin. The possible antibiotic resistance mechanisms seemed likely by the mvolvement of the increased transcription level of smeDEF.
KEY WORDS Stenotrophomonas maltophilia; Antibiotic resistance; Efflux pump; Induction
嗜麥芽寡養單胞菌是機會致病菌，近10年來該菌所致的感染不斷上升，已成為醫院內感染的重要的致病菌之一，可引起身體多個部位的炎症及敗血症，其中在下呼吸道感染的分離率高。嗜麥芽寡養單胞菌耐藥性強，對臨床使用的多數抗生素都具有耐藥性［1，2］， 對部分抗生素甚至高度耐藥。嗜麥芽寡養單胞菌內源性和獲得性多重耐藥機製可能與存在多重外排泵有關，已發現的外排泵SmeDEF對多種毒性物質和包括氟喹諾酮類的多種抗生素有外排作用［3］。研究顯示SmeDEF的表達水平與該菌多重耐藥程度有關。了解藥物外排泵及其調控機製對於該菌多重耐藥本質的認識和藥物作用靶位的研究均有重要意義。目前對嗜麥芽寡養單胞菌外排泵SmeDEF表達調控機製的研究較少，發現SmeT蛋白對SmeDEF轉錄有阻遏作用。已有研究發現多藥外排泵如大腸埃希菌AcrAB泵的表達能被膽鹽和某些抗菌藥物所激發，可能與感染時大腸埃希菌耐藥表型的誘導有關［4，5］。外排係統調控機製複雜，是否在嗜麥芽寡養單胞菌中也有這樣的誘導機製？本研究對嗜麥芽寡養單胞菌臨床株在抗菌藥物誘導下的表型和藥物外排泵SmeDEF表達進行分析，探討這些變化在耐藥中所起作用。
1 材料與方法
1.1 材料
(1)菌株來源 嗜麥芽寡養單胞菌臨床株H407和A26分別來自感染者的痰與氣管吸出物。銅綠假單胞菌ATCC27853和大腸埃希菌ATCC25922作藥敏實驗質量控製。
(2)抗菌藥物和主要化學試劑 抗菌藥物為氯黴素和環丙沙星；標準品購自北京天壇生物製品研究所。泵抑製劑CCCP為Sigma公司產品。培養基為LB肉湯、MH和LB瓊脂，溴化乙啶(EB)為Sigma公司產品。SV Total RNA Isolation System、RT-PCR係統(Cat.#1260)和瓊脂糖購自Promega公司產品。分子量標準DL-2000購自TaKaRa公司。
1.2 方法
(1)抗菌藥物誘導和非誘導時的MIC值 取LB平皿上過夜生長的單菌落，分別接種於含環丙沙星(濃度為1/3MIC)的LB肉湯，孵育過夜；離心沉澱後重溶，多點接種於含和不含25μg/ml CCCP的環丙沙星和氯黴素的倍比稀釋MHA平皿上，濃度105CFU/spot，
(2)抗菌藥物誘導的菌株耐藥性—平皿效率實驗(EOP) H407和A26同時進行以下兩組實驗。一組取LB平皿上過夜孵育的菌落，105CFU/ml 2.5μl塗布於含氯黴素(濃度為0.8MIC)的MHA平皿和空白對照平皿。另一組在含環丙沙星(濃度為1/3MIC)的LB平皿過夜孵育的菌落，稀釋後同樣塗布於含氯黴素的平皿和空白對照平皿，
(3)檢測誘導前後smeD表達(RT-PCR) 菌株H407和A26同時進行以下三組實驗。一組在LB肉湯中，
以嗜麥芽寡養單胞菌β-內酰胺酶L2的基因blal2的258bp片段(引物：上遊B1，下遊B2)作為參照進行RT-PCR，RNA約0.5μg。
2 結果
2.1 實驗菌株的耐藥特性
H407和A26對抗菌藥物耐藥表型和一般特性列表2。其中H407對諾氟沙星、環丙沙星和氧氟沙星敏感，在使用泵抑製劑後MIC無變化；A26對以上幾種藥物也敏感，但在加泵抑製劑CCCP後對氯黴素的MIC值降至原值的1/4。藥物敏感性變化見表3。
2.2 抗菌藥物誘導和非誘導時的MIC值
H407和A26與環丙沙星過夜孵育後對氯黴素和環丙沙星MIC比正常非誘導時MIC高1～3個稀釋度，其中A26經誘導後對環丙沙星和氯黴素的MIC分別增長3和2個稀釋度，大於H407的2和1個稀釋度。加泵抑製劑CCCP後，H407和A26誘導株的MIC均有明顯下降，除A26誘導株被CCCP抑製後的氯黴表1 擴增反應使用引物表2 實驗菌株的一般特性表3 H407和A26對環丙沙星誘導和非誘導時的素MIC降至無誘導時被抑製的水平(8μg/ml)，H407和A26誘導株加CCCP後的其餘MIC均比無誘導時加或不加泵抑製劑的MIC值高，提示經環丙沙星誘導的菌株在抑製外排作用後對環丙沙星的耐藥性明顯下降，但未恢複至誘導前被抑製的敏感水平，甚至未達到無誘導時的敏感性。
2.3 抗菌藥物誘導菌株的EOP結果
EOP是更為準確的測量不同菌群中耐藥水平的方法。H407誘導前氯黴素的EOP值為0.075，環丙沙星誘導後的氯黴素EOP為0.28，顯示有近4倍的增長。A26無環丙沙星誘導時氯黴素的EOP值為0.12，誘導後的EOP為0.57，顯示耐藥性增長了4.8倍(表3)。
2.4 抗菌藥物誘導和非誘導株smeD的RT-PCR結果
H407和A26在亞抑菌濃度環丙沙星誘導後，smeD的mRNA水平增高，在3個RNA濃度下均可見添加抗菌藥物的兩組比對照組的RT-PCR條帶亮度高，抗菌藥物過夜組與指數期添加組的亮度無明顯不同。作為對照的blal2 mRNA水平誘導前後無明顯改變。圖1、2為A26菌株smeD和blal2的RT-PCR電泳結果。
3 討論
外排泵(efflux pump)作為一種抗菌藥物耐藥的機製，首先報道於20世紀80年代初。之後，在許多細 A、D、G：指數期添加組； B、E、H：抗菌藥物過夜組；菌中發現外排泵介導的多重抗菌藥物耐藥，例如NorA、AcrAB、RobA、MexAB以及Bmr等［8～11］。有證據表明嗜麥芽寡養單胞菌的多重外排泵是其固有和獲得性多重耐藥的最重要原因。SmeDEF外排泵是嗜麥芽寡養單胞菌與耐藥有關的重要的外排泵，SmeDEF的外排底物有喹諾酮類、四環素、氯黴素、大環內酯類等結構不相關的抗菌藥物。Li等［12］實驗中野生株ULA511的smeDEF低表達，野生株SmeDEF的耐藥譜與高表達smeDEF的MDR突變株相同。Aloson等［13］發現僅部分嗜麥芽寡養單胞菌臨床株的smeDEF有轉錄活性，存在活性SmeF。一般認為一些多重外排泵在細菌的正常生長代謝中起作用［14］，本研究室也證實smeDEF基因廣泛存在於嗜麥芽寡養單胞菌臨床株中，而且該基因的轉錄水平與菌株的耐藥程度有關［7］。
已知決定外排泵活性大小的最常見因素是調控其表達的一些因子的變化，這些調控因子或作用對象的改變對耐藥性變化的影響不完全一致。包括革蘭陰性菌的多種致病菌中，多藥外排係統的結構基因常在附近調控基因編碼蛋白的嚴謹降調控下［4，15］，外排泵的高表達常常由於這些調控基因的突變所致。但有些外排泵的調控機製更為複雜，如調節大腸埃希菌Mar耐藥的情況。與泵有關的耐藥機製中，可因耐藥調控有關的一些編碼/非編碼序列的改變［16，17］，或調控因子活性變化而使外排泵轉錄或翻譯升高，而增加菌株的耐藥性。
(1)SmeT的實驗研究 SmeT是SmeDEF轉錄的阻遏子，SmeT蛋白屬於TetR和AcrR轉錄抑製子家族。SmeT的編碼基因660bp，位於smeD上遊223bp，SmeT與SmeDEF反方向轉錄。smeDEF和smeT分別有單啟動子PsmeDEF和PsmeT，兩個基因啟動子可能交互影響。Sanchez等［3］的研究中，SmeT在敏感菌株D457中低表達，而在耐藥株D457R的表達水平高，SmeT可能同時降調控SmeT自身轉錄。SmeT在敏感菌中濃度有限，人為地增加其表達可進一步提高菌株敏感性。這可能是野生SmeT對SmeDEF外排泵本底表達的調控，使之在生理條件下起作用。
(2)誘導機製的研究 嗜麥芽寡養單胞菌外排泵SmeDEF的表達亦受到生長周期的調控，SmeDEF和SmeT的表達也可能以不同方式對環境和生理信號起反應［13］。除了生長相調控，嗜麥芽寡養單胞菌有否類似一些外排係統由水楊酸類似物等天然活化信號分子或抗菌藥物底物激發，表達增加的機製？此前還未有嗜麥芽寡養單胞菌外排泵可被其底物誘導的報道。
通過檢測嗜麥芽寡養單胞菌H407和A26(泵抑製陽性和陰性的敏感菌株)的MIC和EOP值，觀察到在亞抑菌濃度的環丙沙星中生長後對抗菌藥物的耐藥性均有所提高，而且這種增加的耐藥性均能在泵抑製劑作用下降低，但對泵抑製劑不敏感的H407未恢複至誘導前被抑製的敏感水平，甚至未達到無誘導時菌株的敏感性。所以，外排作用在這樣的耐藥水平增加中很重要，而且還有其它機製參與誘導後的耐藥性增加。對mRNA水平監測發現環丙沙星誘導後SmeDEF泵的表達亦有顯著增高，而在指數期抗菌藥物作用1h已有明顯的提高，說明誘導作用主要發生在轉錄調控方麵，關於其它泵的誘導實驗證實了這一機製［6］。這也可能解釋在有的病例中，如環丙沙星等抗菌藥物治療過程中嗜麥芽寡養單胞菌耐藥性增加的情況，以及在臨床中發現的治療與體外藥敏實驗結果不符的部分病例。
對誘導物和阻遏蛋白的作用，及與基因調控的研究已有很長時間，報道有些外排泵的底物如膽鹽及多種藥物有誘導外排泵表達的作用［5，18］。研究顯示誘導作用可通過底物與外排泵的負調控子相互作用而實現［6，10］，或某些誘導作用通過與正調控子的作用。金葡菌QacA多重外排泵的負調控子QacR［19］，以及四環素外排泵TetA的負調控子TetR和大腸埃希菌多重外排泵EmrAB的EmrR，均直接參與誘導作用［10，11］。根據同族蛋白的變化，推測嗜麥芽寡養單胞菌的誘導過程：抗菌藥物進入細菌體內後，直接或通過中間代謝產物，與阻遏蛋白SmeT結合，不是建立或斷裂個體之間的鍵，而是改變蛋白形狀，降低其與操作區的親和力。兩分子的誘導物結合於四聚體足以解除其抑製作用。誘導物的結合改變了帽相對於核心的方向，使得一個二聚體內的兩個帽不再能同時結合DNA，消除了多聚的優點，降低了對操作區的親和力，從而改變了阻遏蛋白在DNA鏈上的分布［20］。除了環丙沙星能誘導嗜麥芽寡養單胞菌耐藥性的提高，應該還有其它一些外排泵底物或類似物可以作為誘導劑調節泵的表達水平。
(3)其他可能的機製 根據已知與泵有關的耐藥機製的結論和本研究的結果，嗜麥芽寡養單胞菌臨床株有關SmeDEF的耐藥性除有誘導機製，還可能有非編碼基因序列的變化引起結構基因smeD轉錄或翻譯增強，或可能通過阻遏蛋白SmeT作用發揮所需的序列變化影響。本室前期研究發現耐藥菌SmeT阻遏蛋白序列出現Asp218Glu氨基酸替換，以及125、136、138和148位氨基酸多個位點的替換。Sanchez等實驗室檢測序列分析證實SmeT的leu166Gln氨基酸突變導致了嗜麥芽寡養單胞菌D457R的蛋白活性下降。可能為影響蛋白的穩定性，SmeT抑製活性降低或失活。不同耐藥機製單獨或可能聯合起作用，增加臨床菌株與多重外排有關的耐藥性。該菌對喹諾酮等抗菌藥物的耐藥性可能還有除了泵的其他機製，如還未得到證實的可能的靶酶突變［20］。
本研究僅就SmeDEF外排泵的底物誘導作用作一初步探討，這些發現在國內、外尚屬首次。嗜麥芽寡養單胞菌SmeDEF外排泵的調控機製很複雜，可能有眾多的順式和反式因子對表達起作用。有關嗜麥芽寡養單胞菌臨床株SmeDEF外排泵的表達調控及與耐藥性產生的具體機製還有待今後進一步明確。
作者：孫二琳 宋詩鐸 祁偉 王玉寶《中國抗生素雜誌》
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