【摘要】 目的 了解臨床分離的54株大腸埃希菌對氨基糖類苷類抗生素的耐藥譜及產ESBLs情況，分析氨基糖苷類修飾酶AAC(3)-II的檢出率及該酶的一些特征。方法采用MIC法測定臨床分離的54株大腸埃希菌對7種氨基糖苷類抗生素的耐藥譜，用NCCLS推薦的酶抑製劑增強紙片擴散法檢測產ESBLs菌株，並通過聚合酶鏈反應、克隆測序和測定重組菌耐藥譜對aac(3)-II基因進行研究。結果 54株大腸埃希菌對阿米卡星、慶大黴素、卡那黴素、妥布黴素、鏈黴素、大觀黴素和奈替米星的耐藥率分別為14.8%、77.8%、59.3%、66.7%、68.5%、61.1%、22.2%；共檢測出產ESBLs菌株34株，占63.0%；aac(3)-II基因在54株大腸埃希菌中檢出率為88.5%；質粒轉化菌產ESBLs且同時檢出aac(3)-II基因。重組菌BL21(DE3)/pET26：：aac(3)-II對慶大黴素和卡那黴素有耐藥性，對其餘5種氨基糖苷類抗生素沒有表現出耐藥性。結論大腸埃希菌對慶大黴素的耐藥率最高，對阿米卡星的耐藥率最低；耐氨基糖苷類抗生素的大腸埃希菌與其產ESBLs有相關性；重組菌BL21(DE3)/pET26：：aac(3)-II僅對慶大黴素和卡那黴素產生耐藥。
【關鍵詞】 大腸埃希菌； 氨基糖苷類抗生素； 修飾酶； 超廣譜β內酰胺酶； 耐藥性
Research on aminoglycoside resistance profiles and producing ESBLs
ABSTRACT Objective To investigate the aminoglycoside resistance profiles and producing ESBLs of clinical Escherichia coli strains and analyze the characteristic of AAC(3)-II. Methods MIC tests of 7 aminoglycosides and ESBLs confirmation tests were performed 54 strains of E.coli aac(3)-II gene was amplified by PCR and cloned into pET26b, then and sequenced. Activity of AAC(3)-II was tested by MIC method. Results The resistant rates of 54 strains of E.coli to amikacin, gentamicin, kanamycin, tobramycin, streptomycin, spectinomycin, netilmicin were 14.8%, 77.8%, 59.3%, 66.7%, 68.5%, 61.1%, 22.2% and 63.0% (34/54) of strains were found producing ESBLs. The positive rate of aac(3)-II gene was 88.5% (45/54). The aac(3)-II gene resistance to gentamicin and kanamycin, but not other 5 aminoglycosides. Conclusions Fifty-four strains of E.coli had the highest resistant rate to gentamicin while had the lowest resistant rate to amikacin. ESBLs-producing strains were mostly in aminoglycoside -resistance E.coli. The aac(3)-II gene only mediates resistance to gentamicin and kanamycin.
KEY WORDS Escherichia coli; Aminoglycosides; Modifying enzymes; Extended-spectrum beta-lactamases; Antibiotic resistance
大腸埃希菌(E.coli)是條件致病菌，2002年全國細菌耐藥性監測網對所屬57家三級甲等醫院的調查發現，其臨床分離率列第一位(14.2%)［1］。目前國內對大腸埃希菌的多重耐藥性已引起很大的重視，對β-內酰胺類、氨基糖苷類抗生素(aminoglycosides)的耐藥機製有較多的研究，但兩者相關性的研究還不多。以54株從臨床分離的大腸埃希菌為研究對象，測定菌株對7種氨基糖苷類抗生素的最低抑菌濃度(MIC)及檢測其產超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)，為臨床合理有效地應用抗生素提供依據；同時克隆aac(3)-II基因到pET26b，檢測重組菌BL21(DE3)/pET26：：aac(3)-II對氨基糖苷類抗生素的耐藥譜，為進一步研究aac(3)-II基因奠定基礎。
1 材料和方法
1.1 實驗菌株及質粒
收集從2005年2～8月溫州醫學院附屬第一醫院臨床送檢的血液、腹水、尿液等無菌體液標本分離得到的大腸埃希菌，紙片法測定其對慶大黴素(gentamicin，抑菌圈直徑≤
1.2 體外最低抑菌濃度的測定
采用瓊脂稀釋法測定阿米卡星(amikacin A)、慶大黴素、妥布黴素、卡那黴素(kanamycin)、奈替米星(netilmicin)、大觀黴素(spectinomycin)、鏈黴素(streptomycin)對54株大腸埃希菌的MIC，以大腸埃希菌ATCC25922為質控菌株，按CLSI/NCCLS(2004)版解釋實驗結果［2］。
1.3 超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)的檢測
ESBLs的檢測采用NCCLS推薦的酶抑製劑增強紙片擴散法。頭孢噻肟(CTX)、頭孢他啶(CAZ)、頭孢噻肟/克拉維酸(CD3)、頭孢他啶/克拉維酸(CD2)紙片為英國Oxoid公司產品。單藥紙片(CTX、CAZ)與相應的含酶抑製劑紙片(CD3、CD2)中任何一對的抑菌環直徑之差≥
1.4 質粒的提取及轉化
用質粒提取試劑盒提取臨床分離菌株WYD1094、WYD1102的質粒，並轉化到感受態細胞BL21(DE3)，塗布於含慶大黴素(8μg/ml)的LB固體培養基中，挑取生長的單個菌落，並分別記作為BL21/WYD1094，BL21/WYD1102。提取轉化菌的質粒，1.0%瓊脂糖凝膠電泳。按“
1.5 氨基糖苷類修飾酶基因aac(3)-II的檢測
自行設計aac(3)-II基因引物，並在引物上添加酶切位點，上遊引物5′-GGCATATGATFCATACG-CGGCAAGGCAAT-3′(下劃線處為NdeI酶切位點)，下遊引物5′-TTCCCCTCGAGCTAACCGG-AAGGCTCGCAGG-3′(下劃線處為XhoI酶切位點)，PCR產物長度為877bp。采用堿裂解法提取細菌質粒DNA。50μl的PCR反應體係中包括：10×反應緩衝液5μl、5mmo/LMgC12 3μl、2.5mmol/L的4種dNTPs Mix 4μl、引物(20μmol/L)各2μl、Taq DNA聚合酶2.5U和模板2.5μl。PCR反應條件：
1.6 aac(3)-II基因的克隆及重組菌的耐藥譜
選取一份PCR陽性產物經純化回收，NdeI和XhoI雙酶切後與經相同雙酶切後的表達載體pET26b連接；連接產物轉化到BL21(DE3)感受態細胞並塗布到含卡那黴素25μg/ml的LB固體培養基中；挑取生長的單個菌落，經PCR和NdeI-XhoI雙酶切證實為重組菌BL21(DE3)/pET26：：aac(3)-II；采用瓊脂稀釋法測定上7種氨基糖苷類抗生素的MIC，同時以BL21(DE3)和BL21(DE3)/pET26b為對照，大腸埃希菌ATCC25922為質控菌株，結果解釋同前。
2 結果
2.1 大腸埃希菌對7種氨基糖苷類抗生素的MIC
紙片法示54株大腸埃希菌對慶大黴素、卡那黴素和妥布黴素其中一種或以上耐藥。54株大腸埃希菌對7種氨基糖苷類抗生素的MIC結果如表1所示。
2.2 大腸埃希菌對阿米卡星、慶大黴素和妥布黴素的耐藥表型及產ESBLs的檢測結果
54株大腸埃希菌對三種氨基糖苷類抗生素的耐藥表型如表2所示。用NCCLS推薦的ESBLs表型確證法檢測到34株陽性菌株，占63.0%。 表1 54株大腸埃希菌對7種氨基糖苷類抗生素表2 54株大腸埃希菌對三氨基糖苷類抗生素的
2.3 臨床分離菌的質粒轉化菌結果
2株轉化菌的質粒經提取、電泳後均示一條條帶；對氨基糖苷類抗生素的MIC如表3所示；同時均產ESBLs。
2.4 aac(3)-II基因的PCR及測序結果
在54株大腸埃希菌中共檢測出PCR陽性45株(占83.3%)；陽性產物均經測序並在GenBank與已登錄的序列作比對，結果一致。
2.5 aac(3)-II基因的克隆及重組菌的耐藥譜結果
重組菌經PCR和雙酶切後證實，aac(3)-II基因成功克隆並轉化，重組菌對氨基糖苷類抗生素的耐藥結果如表3所示。 表3 2株質粒轉化菌及重組菌對7種氨基糖苷類抗生素的MIC(μg/ml)
3 討論
(1)氨基糖苷類抗生素是一類由氨基環醇、氨基糖與糖組成的抗生素的總稱，包括慶大黴素、卡那黴素、阿米卡星、鏈黴素等。氨基糖苷類抗生素依賴電子轉運，通過細菌內膜到達胞質中，與核糖體30S亞基結合。雖然這種結合並不阻止起始複合物的形成，但能通過破壞控製翻譯準確性的校讀過程來幹擾新生鏈的延長，導致細菌的死亡［3］。由於氨基糖苷類抗生素在臨床上和動物細菌性疾病的預防與治療中長期和不合理的應用，使細菌對其耐藥性顯得日益突出。在本研究中，從臨床分離的大腸埃希菌對慶大黴素的耐藥率最高，達到77.8%，其次為妥布黴素(66.7%)和卡那黴素(59.3%)，對阿米卡星的耐藥率最低(14.8%)，這可能與阿米卡星是經過結構改造、能抵抗氨基糖苷修飾酶的半合成氨基糖苷類抗生素有關［3］。本研究結果與姚蕾等［4］報道的2004年北京地區大腸埃希菌耐氨基糖苷類抗生素的結果基本相似，但卡那黴素的耐藥率比姚蕾等報道的高(北京地區為40.6%)，這可能與不同地區有不同的用藥習慣有關。大腸埃希菌對奈替米星的耐藥隻有22.2%，但對其中度敏感的比率卻達50.0%，這可能是因為奈替米星作為第三代氨基糖苷類抗生素在結構上作了改進，使得AAC(3)-II對奈替米星的修飾作用受到部分限製但不能完全排除影響［3］。54株大腸埃希菌中有8株細菌對阿米卡星耐藥，其中有7株為高水平耐藥(MIC≥512μg/ml)且對其他6種氨基糖苷類抗生素也有較高水平的MIC值(均MIC≥128μg/ml)，顯然，這種對幾乎所有氨基糖苷類抗生素高水平的耐藥現象可能存在有多種耐藥機製或高水平耐藥機製，如16S rRNA甲基化酶［5］。
(2)超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)是指由質粒介導的能賦予細菌對頭孢菌素類、氨曲南以及青黴素類廣泛耐藥的一類酶。有學者認為［6］，以亞胺培南為代表的碳青黴烯類抗生素對細菌所產的大部分β-內酰胺酶穩定，氨基糖苷類抗生素對這一類細菌亦然，特別是對阿米卡星耐藥率在20%。在治療由產ESBLs大腸埃希菌感染時可以采用氨基糖苷類抗生素加頭黴烯類抗生素，或氨基糖苷類抗生素加β-內酰胺酶抑製劑類抗生素聯合用藥方案。段建春等報道［7］，在產ESBLs的大腸埃希菌中aac(3)-II基因的檢出率高達80%。在本研究中，共有34株細菌產ESBLs，其中有30株為aac(3)-II基因陽性，占88.2%；在45株aac(3)-II基因陽性的細菌中，有30株產ESBLs(占66.7%)，這個比例比一般的大腸埃希菌中產ESBLs檢出率高［8］。將臨床分離菌的質粒轉化到BL21中，提取質粒並電泳後示僅單一條帶；同時檢測到aac(3)-II基因和產ESBLs，說明這兩種基因在同一個質粒上。Patterson等［9］認為氨基糖苷類修飾酶基因與ESBLs基因可在同整合子上，表現出多重耐藥。由於在本實驗中沒有作整合子的檢測，所以不能認為它們在同一整合子上，但可以認為這兩個基因很可能會同時隨著質粒而傳播耐藥性。因此在治療產ESBLs的大腸埃希菌時，應考慮其可能同時攜帶有aac(3)-II基因或其他氨基糖苷修飾酶基因，避免使用此類抗生素。
(3)到目前為止，細菌對氨基糖苷類抗生素產生耐藥的分子機製主要有以下五種：①細菌產生一種或多種修飾酶，使進入細菌胞內的抗生素失去生物活性；②抗生素作用靶位的改變、核糖體堿基發生變化或與核糖體結合的核蛋白氨基酸發生突變，使抗菌藥物無法發揮作用；③細菌細胞膜通透性改變，使進入胞內的抗菌藥物減少；④細菌通過主動外排(active efflux)機製將已進入胞內的藥物泵至胞外；⑤細菌產生16S rRNA甲基化酶。細菌對氨基糖苷類抗生素耐藥主要是由於產生了一種或多種氨基糖苷類修飾酶(AMEs)。AMEs分為三大類，即乙酰轉移酶(AAC)、核苷轉移酶(ANT)和磷酸轉移酶(APH)。此類酶作用於氨基糖苷類抗生素特定的氨基或羥基，使抗生素發生鈍化，使其降低或喪失對靶位核糖體的親和力［10］。產AAC(3)-II是大腸埃希菌對氨基糖苷類抗生素耐藥中最常見的耐藥機製之一［4］。在本研究的54株對氨基糖苷類抗生素耐藥的大腸埃希菌中，aac(3)-II基因的檢出率為83.3%(45/54)。根據氨基糖苷類抗生素的耐藥性分為三種耐藥表型(表2)：G-T型、G型和G-T-A型，其中G-T型占多數且全部檢出aac(3)-II基因，這與孔海深等［11］報道的結果相類似。這種耐藥表型與基因型並不完全一致的原因可能是由於氨基糖苷類修飾酶基因多數由整合子介導，且一個整合子可攜帶多個修飾酶基因［12］；耐藥基因盒的表達不僅依賴於啟動子的強弱，而且與啟動子的距離遠近有關：上遊基因表達強，下遊基因表達弱甚至不表達［13］。6株對慶大黴素敏感且檢出aac(3)-II基因的大腸埃希菌的藥敏結果顯示，這6株對奈替米星、卡那黴素、鏈黴素、大觀黴素、阿米卡星和妥布黴素中的一種或多種耐藥。有學者［3］認為aac(3)-II基因可以以沉默狀態存在，表現為不耐藥；同時修飾酶在細胞內的定位也可能使有該酶基因的檢出但不表現為耐藥；而對奈替米星和妥布黴素等AAC(3)-II底物的耐藥可能是由於這些菌株中存在的其他耐藥機製所致，如產AAC(6′)-I。
(4)在本研究中，成功地克隆了一株aac(3)-II基因的重組菌BL21/pE26b：：aac(3)-II。重組菌的藥敏試驗發現，重組菌對慶大黴素和卡那黴素有耐藥性，對奈替米星和妥布黴素以及其他氨基糖苷類抗生素沒有產生耐藥性。這可能是aac(3)-II基因在重組狀態下所產生的重組蛋白在蛋白的正確折疊、二硫鍵形成與天然蛋白質有一定的差別，使酶的活性發生了改變。由於慶大黴素的結構較妥布黴素等簡單，其I環3位氨基處於沒有其他空間阻隔的狀態，易被修飾酶所攻擊［3］；同時現在也有學者認為妥布黴素與核糖體結合的部位不止一個，妥布黴素可以以對稱或不對稱的方式二聚體化後以擴大範圍，這樣減少修飾酶對妥布黴素的修飾作用而發揮抗菌能力［14］。
綜上，大腸埃希菌對氨基糖苷類抗生素的耐藥譜中，對慶大黴素的耐藥率最高(77.8%)，對阿米卡星最低(14.8%)。在對氨基糖苷類抗生素耐藥的大腸埃希菌中，ESBLs的檢出率較高(63.0%)，為臨床上合理選擇和使用抗生素提供實驗依據。
作者：陳雲波 王震 查長森 鄒立林 季敬章 彭穎 呂建新《中國抗生素雜誌》
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