摘 要
2000年4月，陝西省岐山縣種豬繁育場仔豬流行關節炎和敗血症。無菌采取患關節炎豬的關節液和患敗血症豬的肝、肺、脾及腸係膜淋巴結各8份病料，並對這16份病料進行病原菌分離試驗、血清學鑒定、致病力試驗、保護力試驗、細菌回收試驗、藥敏試驗。結果表明：該病原菌為2型豬鏈球菌，引起關節炎的豬鏈球菌較引起敗血症的豬鏈球菌致病力弱；該菌對頭孢菌素、青黴素高度敏感。
關鍵詞：豬鏈球菌 分離鑒定
前 言
豬鏈球菌（Streptococcosis suis）是豬的一種重要疾病，養豬業發達國家如美、英、荷及愛爾蘭等常有本病發生。我國於1958年就有豬鏈球菌病的報道，1976年我國南方幾省曾一度廣泛流行，給我國養豬業帶來了很大危害。
豬鏈球菌截止到目前已發現的莢膜型已超過30種[1]。我國於1995年首例鑒定證實2型豬鏈球菌在我國的存在 [2]。豬鏈球菌可致2—6周齡仔豬敗血症、腦膜炎、關節炎及支氣管肺炎等[3-7]。病豬和帶菌豬是本病的重要傳染源，病豬的鼻液、尿液、血液、肌肉、內髒和關節內均可檢出病原體。未經無害處理的病死豬肉、內髒及廢棄物是散播本病的重要原因，呼吸道是本病的主要傳播途徑。本病一年四季均可發生，但以4—10月份發生較多。本病常為地方性流行性，多呈敗血性。短期波及全群，如不進行防治，則發病率、病死率很高，慢性常為地方性散發性傳染。
2000年4月，岐山縣種豬繁育場仔豬流行關節炎及敗血症，多為2—6周齡仔豬。無菌采取關節炎病豬的關節液及敗血症病豬的肝、脾、肺及腸係膜淋巴結，經實驗室分離鑒定，證實為2型豬鏈球菌。現將分離鑒定結果報告如下。
1． 實驗材料
1． 1病料 無菌采取岐山縣種豬繁育場患關節炎病豬的關節液8份，編號為1—8號，無菌采取患敗血症豬的肝、肺、脾及腸係膜淋巴結8份，編號為9—16號。
1． 2試劑 試驗所用的各種糖均購自上海化學試劑二廠，批號自95—98年不等。
1． 3培養基 綿羊鮮血平板、匹克氏增菌液、10ml/L豬血清肉湯及各種糖培養基按常規方法製備[8]。
1． 4血清學試驗 豬鏈球菌診斷血清與平板凝集抗原均購自中國獸藥鑒察所，批號為990705。
1． 5藥敏紙片 購自浙江省軍區後勤部，批號20000312。
1． 6試驗動物 健康小白鼠（30—35g）50隻，購自第四軍醫大學實驗動物中心。
2． 方法
2． 1 病原分離
將所采病料分別塗片，革蘭氏染色鏡檢，然後，分別接種鮮血瓊脂平板。37℃需氧培養24h後，挑取可疑菌落接種於匹克氏增菌液，37℃培養24h後，革蘭氏染色，顯微鏡檢查，再接種血清肉湯，純化後放置4℃，冷藏備用。
2．2 分離菌株的鑒定
2．2．1生化試驗
隨機抽取上述分離菌血清肉湯培養物3#、8#、13#、15#，分別接種於蔗糖、山梨醇、棉實糖、葡萄糖、甘露糖、蕈糖、乳糖、菊糖、水楊苷、馬尿酸鈉培養基，37℃培養24h後，觀察其對糖的利用情況。
2．2．2血清學鑒定
將3#、8#、13#、15#菌經緩衝肉湯培養8h，通過3000r/min離心10min，PBS洗滌2次，用Ph7.2 的0.01mol/L PBS製成 1*10 10~2*10 10細菌懸液。取1滴上述細菌懸液與適當的抗血清在潔淨玻片上混勻，立即觀察凝集現象。同時，設立細菌懸液對照及血清對照。
2．3 致病力及保護力試驗
2．3．1菌落形成單位的測定 按常規方法進行[9]
2．3．2致病力試驗
無菌吸取上述血清肉湯培養物（含菌量5.0*10 8CFU/ml）以0.1ml /隻、0.2ml/隻、 0.3ml/隻、 0.4ml /隻、0.5ml/隻分別腹腔注射小白鼠2隻，觀察其死亡時間和數量，測定其最小致死量。再將上述血清肉湯培養物腹腔注射小白鼠，小白鼠共14隻，分7 組。第一組，每隻小白鼠注射3#菌0.2ml，第二組每隻注射8#菌0.2ml，第三組每隻注射3#、8#菌各0.1ml，第四組每隻注射13#菌0.2ml，第五組每隻注射15#菌0.2ml，第六組每隻注射13#、15#菌各0.1ml，第七組每隻注射無菌血清肉湯1.0ml。以上各組分別飼養觀察其死亡時間及數量。
2．3．3保護力試驗
將3#、8#、13#、15#血清肉湯培養物分別接種於18 cm鮮血平板。37℃培養24h後，收菌，用麥氏比濁管比濁，適當稀釋，然後用0.3%甲醛滅活；37℃作用24h；作無菌檢驗。然後分別腹部皮下接種小白鼠2隻，0.4ml/ 隻。10天後，再分別人工感染，0.2ml/隻。
2．3．4細菌回收試驗
對致病力試驗出現症狀及死亡小白鼠剖檢，並采集病料，進行分離。
2．4藥敏試驗
采用紙片擴散法，用無菌棉簽蘸取分離菌的血清肉湯培養物，均勻塗布於9cm鮮血平板；待稍幹後，用無菌鑷子將各種藥敏紙片分別平貼在培養基表麵，4℃2h使藥物擴散，然後置37℃培養20—24h，觀察結果。結果按抑菌圈直徑大小和各抗菌藥的具體標準，評定為高度敏感、中度敏感或耐藥。結果評定參照表1。
表 1 各種抗菌藥物的抑菌圈與敏感標準
3．結果
3．1分離細菌的培養特性及形態特征
3．1．1培養特性
37℃培養24h後，所采的12份病料在鮮血瓊脂平板上形成表麵光滑、隆起的灰綠色小菌落，外層有明顯的β溶血環。該菌在匹克氏增菌液中底部有沉澱，在血清肉湯中先均勻渾濁，後在試管底部形成沉澱，上部澄清，不形成菌膜。
3．1．2染色特性
關節液、鮮血瓊脂、匹克氏增菌液及血清肉湯培養物塗片、革蘭氏染色、顯微鏡檢查為革蘭氏陽性，在關節液、鮮血瓊脂培養物中多呈單個、雙球或短鏈狀排列，在匹克氏增菌液及血清肉湯培養物中多呈長鏈狀。
3．2生化試驗結果（見表2）
表2 分離菌生化試驗結果
判定標準：“+”表示大多數（90%—100%）菌株為陽性；“-”表示大多數（90%—100%）菌株為陰性。
表2表明分離的3#、8#、13#、15#菌的生化反應結果均符合豬鏈球菌的生化特性，說明分離的菌均為豬鏈球菌。
3．3 血清學鑒定結果
將3#、8#、13#、15#細菌懸液與1/2及2型抗血清混合，立即可見明顯的凝集現象，但不與1型及其他型抗血清出現凝集。直接挑取細菌菌落與血清混勻，也能得到一致結果。陰性對照均未見凝集現象。
3．4 致病力試驗結果及保護力試驗結果
3．4．1致病力試驗結果
第一組、第二組小白鼠注射血清肉湯培養物48h內均未見死亡，第三組48h內有一隻死亡，第四組、第五組、第六組在注射血清肉湯培養物18h內全部死亡。死亡後，小白鼠皮膚發紺，剖檢肝、脾、肺、心出血，呈敗血症。第七組健活。由於第一、二、三組死亡數量非常少，所以，再用相同劑量分別背部皮下接種小白鼠各2隻，48h後處死，剖檢發現注射部位有直徑0.9~1.1cm的膿腫，濃汁呈黃綠色。
3．4．2保護力試驗結果 免疫的小白鼠再經攻毒後均未發病。
3．5細菌回收試驗結果
將上述死亡及發病的小白鼠剖檢采集病料，進行細菌分離、生化試驗及血清學鑒定，能得到原分離菌。
3．6藥敏試驗結果（見表3）
表3 藥敏試驗結果
表3表明，結果敏感的藥物依次是：頭孢菌素、青黴素；中度敏感的依次是：潔黴素和卡那黴素；而對土黴素、鏈黴素、慶大黴素具有抗藥性。
4．分析與討論
4．1 豬鏈球菌（Streptoccus suts）是危害養豬業的一種重要病原菌。80年代初，加拿大由豬鏈球菌引起的疾病開始增加。那時僅檢出9種夾膜血清型，其中2型是最常見的。
4．2 豬鏈球菌病在臨床上有敗血型、腦膜腦炎型、關節炎型支氣管炎型等。過去屢有敗血型豬鏈球菌的報道，而關於集約化養豬場關節炎型鏈球菌病的報道較少。本次試驗從患關節炎豬的關節液中成功的分離出了豬鏈球菌。另外，岐山種豬場，約有60%的仔豬流行關節炎，嚴重者可發生敗血症而死亡，給種豬場造成巨大的經濟損失。所以，研究本病可為生產中防製本病提供理論依據。
4．3 病豬和帶菌豬是本病的重要傳染源。病豬的鼻液、尿液、肌肉、內髒和關節內均帶有病原體，所以，我們建議，首先應加強對健康豬的免疫。另一方麵，在發病後，加強病豬和健康豬的隔離，根據實驗室所做的藥敏試驗結果，配合藥物治療，建議用頭孢菌素、青黴素、潔黴素等藥物治療。岐山縣種豬繁育場采納我們的建議後，首先對所有的未發病仔豬用滅活疫苗免疫接種，對已發病的豬用青黴素等藥物配合治療。另外，注意衛生管理。目前該病已得到有效的控製。
4．4 從致病力試驗結果可以看出，引起豬關節炎的豬鏈球菌的致病力較小，而引起敗血症的豬鏈球菌的致病力較強。但通過生化試驗和血清學鑒定，它們又是同種細菌且血清型也相同。為什麽同種血清型的豬鏈球菌的致病力差別很大？這個問題還有待於進一步研究。
作者：朱鳳才 楊華富 胡曉
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