檸檬醛體外誘導白念珠菌耐藥的實驗研究

　摘要：目的探討檸檬醛體外誘導白念珠菌耐藥性的反應情況，進一步評價檸檬醛的臨床應用價值。方法①參照NCCLS M27A方案中的微量液基稀釋法測定檸檬醛和氟康唑對原始白念珠菌的最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MFC)；②采用多步誘導法，觀察在含梯度濃度(1～50MIC)檸檬醛培養基上連續轉種的白念珠菌MIC的變化情況，以氟康唑作為陽性對照，同時設空白對照和溶媒對照；③將敏感性下降的誘導株在無藥培養基上連續轉種10次後，檢測其MIC值；④測定檸檬醛對氟康唑敏感性下降誘導株的MIC值。結果①檸檬醛和氟康唑對原始白念珠菌的MIC值分別為：0.162 μg/ml和2.0 μg/ml；檸檬醛對原始白念珠菌的MFC值為0.324 μg/ml，氟康唑在實驗的最高濃度(64 μg/ml)未發現有殺菌作用。 ②在多步誘導培養過程中，檸檬醛組的MIC值始終保持不變，未誘導出對檸檬醛耐藥的白念珠菌菌株，菌株轉種至含10 MIC檸檬醛的培養基時，即停止生長，而在含50 MIC氟康唑的培養基上菌株仍能生長。氟康唑誘導組菌株在培養過程中，MIC值逐漸升高，轉種至50 MIC時，其MIC (命名為FR株)是其親株的12倍。③FR在無藥培養基上連續轉種10次後得到FR＇，氟康唑在FR＇的MIC為20.16 μg/m，與FR相比，差異無顯著性(P＞0.05)；④檸檬醛對FR的MIC值為0.189 μg/ml，與其相應的原始菌株無差異。結論 檸檬醛不易產生耐藥性，且對氟康唑敏感性下降的誘導株仍敏感。檸檬醛是一種有良好開發前景的抗係統性念珠菌感染的天然藥物。

　　關鍵詞：白色念珠菌；  檸檬醛；  氟康唑；  耐藥

　　Studies on Resistant Induction of Citral to Candida albicans in vitro

　　Abstract：ObjectiveTo investigate whether it is likely to induce Citral-resistant Candida albicans mutations in vitro, in order to give further evaluations of its antifungal actions for clinical use. Methods①The minimum inhibitory concentration(MIC) and the minimum fungicidal concentration(MFC) of citral against C. albicans were measured by broth microdilution method according to document M27-A published by the National Committee for Clinical Laboratory Standards(NCCLS);  ② A C. albicans strain was induced by serial subcultures on agar medium containing different concentrations of Citral (equivalent to 1MIC～50MIC), and 3 groups were set as control groups which were fluconazole group  (positive control), 1.5% alcohol group(solvent control), drug-free group, respectively. The susceptibilities (MIC) of this parental strain and its respective derivatives to Citral and fluconazole were measured.  ③ The induced less susceptible derivatives were subcultured on drug-free medium for 10 times consecutively, then their MICs were tested.  ④ The MIC of induced fluconazole less susceptible derivative to Citral was also measured. Results① MIC of citral and fluconazole against C. albicans were 0.162μg/ml and 2.0 μg/ml, respectively; MFC of citral was 0.324μg/ml and fluconazole with maximum concentration in this experiment was not detected to have fungicidal action.  ② After subcultured to the medium containing 10MIC Citral, there was no visiable colony. No Citralresistant mutants could be induced (the MICs of serial subcultrues were similar to that of the parental one). While the strain could acquire some resistance to fluconazole (up to 12fold the parental MIC, designated FR) with the increase of inducing passages.  ③After FR was subcultured repeatedly on drug-free medium, we got FR' which showed no significant MIC difference with FR.  ④The MIC of FR to Citral was still the similar to that of the parental one.ConclusionCitral is a potential antifungal Chinese herb, and might be used for the treatment in Candidiasis.

　　Key words：Candida albicans;    Citral;   Fluconazole;  Drug tolerance

   

　　近年來，由於各種原因引起免疫機能受損人群的急劇擴大，真菌感染的發病率快速增長，深部真菌感染已成為這部分患者的主要死亡原因之一［1］。過去常采用兩性黴素B、5氟胞嘧啶等治療深部真菌感染，但這類藥物的毒副反應較多。唑類尤其是以氟康唑為代表的三唑類藥物的出現使深部真菌病的治療有所改觀，但隨著這類抗真菌藥物的被廣泛使用，真菌耐藥現象日趨嚴重，使臨床深部真菌感染的治療麵臨極大的挑戰［2］。文獻報道許多中藥對念珠菌都有極好的抑菌和殺菌作用［3］，但中藥在應用過程中能否誘導真菌對中藥產生耐藥性國內外較少報道。本實驗以白念珠菌為研究對象，以中藥山蒼子主要有效成分檸檬醛為誘導劑，並設立氟康唑為陽性對照，采用連續傳代培養方法，觀察了白念珠菌對藥物誘導的耐藥反應，現報道如下。

　　1  材料與方法

　　1.1  材料

　　1.1.1   實驗菌株及菌液配製 白念珠菌(Candida albicans)標準菌株(ATCCC 14053)，北京大學真菌和真菌病研究所提供。將菌株移種在沙氏固體培養基上，置37℃培養24 h，經無菌NS洗滌後用血細胞計數板計數，以沙氏液體培養液或含10％小牛血清RPMIl640培養液( Sigma公司)配成所需濃度待用。

　　1.1.2   培養基RPMI1640培養液：RPMI 1640(Sigma公司)10 g，NaHCO3 2.0 g，嗎啡啉丙磺酸(morpholine propanesulfonic acid，MOPS) 34.5 g(0.165 mol/L)，加三蒸水900 ml溶解，1 mol/L NaOH調pH至7.0(25℃)，定容至1 000 ml，濾過消毒，4℃保存。沙堡葡萄糖瓊脂培養基(SDA)：蛋白腖10 g，葡萄糖40g，瓊脂18 g，加三蒸水900 ml溶解，加入2 mg/ml氯黴素水溶液50 ml，調整pH至7.0，定容至1 000 ml，高壓滅菌後4℃保存。

　　1.1.3  藥品檸檬醛(citral  C10H16O )，比重0.887～0.889，德國進口。使用前用75％乙醇溶解後，用1640液稀釋成41.44 μg/ml；氟康唑(fluconazole, FCZ)由上海三維製藥有限公司提供，批號20041104，用三蒸水溶解配製成1 280 μg/ml的母液作為儲存液。

　　1.1.4   儀器酶標儀，真菌培養箱，紫外分光光度計，電子分析天平。

　　1.2  方法

　　1.2.1   最低抑菌濃度(MIC)及最低殺菌濃度(MFC)測定參照美國國家臨床實驗室標準化委員會(National Committee for Clinical Laboratory Standards，NCCLS)推薦的M27A方案［4］，采用微量稀釋法分別測定檸檬醛和FCZ對實驗原始菌株的最低抑菌濃度(MIC)。將上述藥物濃度大於 MIC的微孔內培養液混勻，各取100 μl，接種於不含藥物的SDA培養基上，37℃孵育5 d，取無菌落生長的最小藥物濃度為藥物的最低殺菌濃度(MFC)。

　　1.2.2  耐藥菌株的誘導將濃度為1.0×105CFU/ml的白念珠菌菌液0.1ml均勻塗至3個含1 MIC藥物的SDA平皿(平皿內徑90 mm) 後，置於37℃恒溫孵育5 d，觀察並計數菌落數，然後，每個平皿隨機挑取3個菌落測定MIC，選取MIC最大者向高一濃度的培養基轉種。以此類推，使菌株於含藥物濃度逐漸升高的SDA培養基上連續轉種(次數與培養基含藥濃度的對應關係為：第1次，1 MIC；第2次，2 MIC；第3次，4 MIC；第4次，10 MIC；第5次，20 MIC；第6次，50 MIC。若菌株在某一濃度含藥培養基未能生長，則該濃度為實驗終濃度，菌株停止向高一濃度培養基轉種。另設空白對照組和溶媒（含1.5%乙醇）對照組，其轉種次數與轉種次數最多的含藥組一致。

　1.2.3  耐藥穩定性將誘導成功後的耐藥株在不含藥物SDA的培養基中培養，每2天轉種1次，每傳2代測1次MIC值，以判斷耐藥的穩定性。

　　1.2.4  檸檬醛對氟康唑敏感性下降誘導株的MIC值測定方法同1.2.1。

　　1.2.5  統計學分析所有數據輸入計算機後，用SPSS10.0統計軟件包進行統計學處理， MIC值組內、組間的比較采用 t檢驗和方差分析，結果以P ＜ 0. 05為具有統計學意義。

　　2  結果

　　2.1  原始菌株MIC值及MFC值的判定 根據M27-A方案，檸檬醛和氟康唑對白念珠菌的MIC值分別為0.162 μg/ml，2.0 μg/ml。檸檬醛對白念珠菌的MFC值為0.324 μg/ml，相當於2 MIC，氟康唑在本實驗的最高濃度(64 μg/ml，相當於32MIC )，未發現有殺菌作用。

　　2.2  各組菌株的生長情況在誘導耐藥過程中，空白對照組和溶媒對照組菌落數最多且穩定，與相應含藥組相比有顯著差異(P＜0.001)。檸檬醛組菌落數較相應氟康唑誘導組少。菌株轉種至含10 MIC檸檬醛(1.62 μg/ml)的培養基上時，即停止生長，而氟康唑組在含氟康唑50 MIC (100 μg/ml )的培養基上仍有菌落生長（將從此培養基上得到的子株命名為FR，Fluconazole Resistancec），見表1。

　　2.3  MIC值的變化情況在連續轉種過程中，檸檬醛誘導組、空白對照組和溶媒對照組各子株的MIC值未見明顯變化，3組之間檸檬醛的MIC值差異無顯著性(P＞0.05) ；氟康唑誘導組菌株的MIC值逐漸升高，轉種至10 MIC (20 μg/ml)時為11.76 μg/ml，是其親株(2.0 μg/ml)的6倍；轉種至50 MIC時為23.52μg/ml (FR)，是其親株的12倍。空白對照組菌株氟康唑的MIC值未見明顯變化(P＞0.05)。氟康唑誘導組和空白對照組菌株之間氟康唑的MIC值差異有高度顯著性(P＜0.001)。各組MIC值的具體變化情況見表2。

　　表1  誘導耐藥過程中各組平皿生長的菌落數比較（略）

　　表2  誘導耐藥前後MIC*的變化（略）

　　*表中數值為各測試時各組MIC最高菌落的MIC幾何均數

　　2.4  耐藥性穩定實驗FR株在空白培養基上連續傳代後各子株MIC值無明顯改變，至第10代其MIC值為20.16 μg/ml，與FR相比，差異無顯著性(P＞0.05)，說明氟康唑誘導產生的耐藥性相對穩定。

　　2.5  檸檬醛對氟康唑耐藥誘導株的抑菌活性檸檬醛對FR的MIC值為0.189 μg/ml，與其相應的原始菌株無明顯差異，說明檸檬醛對氟康唑敏感性下降菌株仍保持很好的抑菌活性。

　　3  討論

真菌耐藥現象日趨嚴重，使臨床深部真菌感染的治療麵臨極大的挑戰。真菌的耐藥性可分為天然性耐藥和獲得性耐藥，前者指暴露於藥物之前就存在的耐藥性，而後者則是指接觸藥物後才出現的耐藥性。獲得的耐藥性既可以是可逆的也可以是穩定的遺傳學改變的結果［5］。文獻報道白念珠菌因自然突變而導致耐藥性發生率很低，而與菌株對藥物的適應性密切相關［6］。白念珠菌耐藥性的產生主要存在以下3種分子機製：麥角甾醇生物合成通路中關鍵靶酶的變化；真菌胞膜內藥物濃度的降低；生物被膜的形成等［7］。無論由於何種機製，菌株獲得耐藥性的穩定性限製了臨床對耐藥株出現後的治療策略，因此，在開發抗真菌新藥和對抗真菌藥物進行評價時，除了對其治療效果進行考察外，從長遠的觀點看，還應考察真菌對它們的適應性進化問題。檸檬醛是從中藥山蒼子提取的一種單體活性成分，我們的既往研究發現其對多種真菌都有較強的抑製作用［8，9］，為評價檸檬醛的臨床應用價值，開發其作為新的抗真菌藥物的可行性，本實驗采用多步驟連續傳代培養法觀察了白念珠菌對檸檬醛的耐藥反應，並以正在廣泛研究的抗真菌藥物氟康唑作為對照。結果發現，隨著培養基中檸檬醛濃度的增加，白念珠菌菌落數逐漸減少，至10 MIC（1.62 μg/ml)時，即無菌落生長，且MIC值始終無明顯變化，而氟康唑組在誘導耐藥過程中，白念珠菌菌落數均高於相應檸檬醛組，至實驗終濃度50 MIC (50 μg/ml )時，菌落仍生長良好，且隨著培養基中氟康唑濃度的增加，處理時間的延長，菌株對氟康唑的敏感性下降(實驗前MIC/實驗後MIC＞10倍)。將誘導對氟康唑敏感性下降的白念珠菌接種在無氟康唑的培養基中連續轉種10代，其耐藥性保持穩定(MIC值變化在1個稀釋度內)。該結果表明，氟康唑能誘導產生耐藥，且獲得的耐藥性是可穩定遺傳的，而檸檬醛不能誘導白念珠產生耐藥性。此外，交叉耐藥實驗結果提示檸檬醛對氟康唑敏感性下降菌株仍保持很好的抑菌活性，推測與在較高濃度時有殺菌作用有關。機體是一個複雜的動態係統，體外實驗結果不一定能反映體內真實情況。檸檬醛的體內代謝過程，具體作用位點及藥物作用後真菌相關基因型的改變還有待進一步研究。

  作者：張文平，王小麗， 黃真，曹鎬祿 《時珍國醫國藥》

　　參考文獻：

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