探討酵母菌塗片半定量檢測在診斷真菌感染中的價值

【摘要】  目的 探討酵母菌塗片半定量檢測在診斷真菌感染中的重要性。方法對不同稀釋度的酵母菌菌液分別進行半定量塗片檢測，同時應用CHR0magar念珠菌顯色培養基進行半定量培養。結果當酵母菌濃度>10 cfu／ml時，半定量塗片、培養與計數成正相關。結論酵母菌檢出數量與菌液濃度呈正相關，塗片半定量與培養有良好的相關性。直接塗片染色鏡檢對真菌感染的早期診斷能提供科學的依據。

【關鍵詞】  真菌感染；酵母菌塗片；半定量檢測

     近20年來，隨著高效廣譜抗生素的廣泛應用，侵襲性真菌感染的發生率呈上升趨勢［1］。在美國，1992～1993年與1980～1982年相比，念珠菌的發病率由2.6/106增至72.8/106。真菌感染患者的上升率占所有病原感染患者上升率的首位。在我國，近幾年真菌檢出率亦呈明顯上升趨勢。加之真菌感染的臨床表現缺乏特異性，早期診斷非常困難，患者大多為免疫力低下患者，所以病情嚴重，發展迅速，治療困難，病死率相當高［2］。因此，需要檢驗工作人員盡快、準確地檢出病原為臨床確診真菌感染提供科學的依據。目前，對真菌感染性疾病進行病原學診斷的常用方法為直接塗片鏡檢和接種培養基分離培養。由於直接塗片染色鏡檢具有簡便和早期快速的特點，因此已在結核分枝杆菌等抗酸性細菌感染的早期初步診斷中廣泛應用［3］。本文擬采用塗片直接鏡檢與分離培養法對含有不同濃度真菌的標本進行檢查，旨在探討塗片半定量對真菌感染標本的診斷價值。

    1  材料與方法

    1.1  材料  菌種白色念珠菌（Candida albicans）為本室保存菌種（一株）。培養基為法國科瑪嘉（CHROmagar）培養基，按說明書配置傾注平板。日本OLYMPUS光學顯微鏡。BASO快速革蘭染液。

    1.2  方法

    1.2.1  改良牛鮑計數盤（NeubaueI·hemocytometer）計數  用無菌生理鹽水將白色念珠菌配成一定濃度的菌懸液，吸取菌液充滿計數盤計數區，在低倍顯微鏡下計數，使濃度為105／ml，再加入生理鹽水稀釋為104、103、102、101／ml。

    1.2.2  半定量塗片檢查  於酒精燈火焰上燒灼載玻片以炭化汙染菌，待冷；用接種環無菌操作，取不同稀釋度菌液一環分別塗片，每個稀釋度塗片5張，革蘭染色後鏡檢。按下述標準記錄半定量結果：全片未見為（-），≤2個／100視野（10×100）為極少量，3～9個／100視野為少量，1～9個／10視野為（+），1～9個／視野為（++），10～99個／視野為（+++），≥100個／視野為（++++）。

    1.2.3  分離培養  以無菌操作取不同稀釋度菌液一接種環（10 μl），分別劃線接種於法國科瑪嘉培養基平板，每稀釋度菌液接種於兩個科瑪嘉平板，置溫箱35 ℃培養24 h後計數菌落數（CFU）。

    2  結果

    2.1  塗片半定量結果  見表1表1  不同稀釋度菌液半定量塗片與培養的結果

    2.2  培養與塗片的關係  菌液濃度≥10 cfu／ml時塗片鏡檢能獲得陽性結果，此時分離培養亦獲得陽性結果。

    2.3  五張塗片結果  通過每稀釋度菌液五張塗片結果發現，每次結果不完全一致。

3  討論

    由表1可知，塗片半定量（++++）相當於菌液濃度104～105 cfu／ml，（+++）相當於菌液濃度為103～104 cfu／ml，（++）相當於菌液濃度為102～103 cfu／ml，（+）相當於菌液濃度為101～102 cfu／ml，當真菌濃度≥10 cfu／ml時，半定量塗片、培養與計數呈正相關，並有良好的相關性。

    直接塗片鏡檢具有快速、簡便、經濟、實用等特點，易於推廣，且可幫助確定真菌的臨床意義，指導標本的正確采集和培養方法的選擇［2］。這就彌補了培養法易受汙染，並且出結果時間長等不足，符合快速診斷真菌感染的要求。

    由於正常人口腔、消化道及泌尿道中存在酵母菌，如果塗片看到真菌，不一定是感染菌，應警惕定植或過路菌。塗片隻能初步判斷是否存在真菌，因此報告結果時應該半定量，給臨床醫師提供一個量的概念，以便醫師通過塗片就能初步判斷是感染還是定植，這樣可以做到早期診斷、早期治療。對呼吸道標本，在保證標本合格以及臨床症狀、體征和（或）醫學影像檢查不能除外呼吸道真菌感染的前提下，直接塗片鏡檢≥少量即可確診［5］。所以直接塗片染色鏡檢時應該報告真菌的量，即做到半定量。

    為了提高直接塗片鏡檢的陽性率，應該正確采集標本，塗片應取標本中的異常部位，液體標本離心後取沉渣塗片［4］。鏡檢時應低倍鏡下觀察全片以免漏檢。一次取材、一張塗片的檢出率僅為55％，即通常所做的塗片方法有45％的漏檢率，用三張塗片的檢出率為75％，因此要增加取材次數，每次多張塗片鏡檢［4］。臨床醫師不應因一次塗片檢測陰性而排除診斷，應該多張塗片多次送檢。如果在抗酸染色等其他染色方法時觀察到真菌應報告臨床，提請醫生注意。

綜上所述，由於酵母菌半定量塗片直接、客觀、快速、影響因素少等特點，可以為臨床快速、早期診斷真菌感染提供科學依據。酵母菌塗片應做到半定量報告臨床，以便幫助臨床醫生迅速判斷有無真菌感染，從而采取適當的治療方法，來挽救病人生命，減輕病人痛苦，節省經濟開支。

 

作者：宋素景，時東彥 《中華現代外科學雜誌》

【參考文獻】

  1 劉偉，李若瑜.抗真菌藥物敏感性試驗在真菌感染防治中的作用.中華檢驗醫學雜誌，2005，28：349-351.

2 盧先雷.臨床真菌檢驗方法的選擇和組合.中華檢驗醫學雜誌，2004，27：201-203.

 

3 朱以勇，王和.感染性標本塗片鏡檢與分離培養相關性的研究.貴州醫藥，2002，26：409-410.

4 程守科.直接塗片鏡檢診斷深部真菌病.內科急危重症雜誌，2001，7：99-100.

5 楊擎立，胡馥生.呼吸道真菌感染病原學診斷標準的探討.中華檢驗醫學雜誌，2003，26：615.