耐亞胺培南的銅綠假單胞菌的研究

銅綠假單胞菌是一種臨床上常見的醫院內的條件致病菌，本研究通過對耐亞胺培南銅綠假單胞菌的耐藥分析，了解耐亞胺培南銅綠假單胞菌的耐藥機製，以利於臨床合理用藥。現報道如下。

　　1.1  資料 

　　(1)菌株：收集自200５年1至12月本院ＶＩＴＥＫ－３２儀檢出的耐亞胺培南銅綠假單胞菌２２株。銅綠假單胞菌標準菌株ATCC 27853一株；(2)藥敏紙片：頭孢塞肟、頭孢曲鬆、頭孢他定、亞胺培南；(3)OprD2基因擴增試劑盒：裂解液A、裂解液B、反應液、耐熱酶、陽性模板；(4)其他：9.8%（EDTA·K2+NA2HPO4），無菌生理鹽水，M-H平板，血平板等。

　　1.2  方法 

　　(1)紙片擴散法初篩：將新分離的純菌種配成0.5McFarland密塗於M-H瓊脂平板（Φ70mm）10min後於平板中央貼上EDTA紙片，紙片分2組：1組為頭孢塞肟、頭孢曲鬆，在距離EDTA紙片1cm處對稱分別貼上頭孢塞肟和頭孢曲鬆。另1組為頭孢他定、亞胺培南，在距離EDTA紙片1cm處分別貼上頭孢他定、亞胺培南。35℃培養24h後觀察結果。結果判斷：①出現協同現象可能為產金屬酶；②不出現協同現象可能為膜通透障礙或既產金屬酶又有膜通透障礙；(2)粗提酶（凍融裂解法）將新分離的純菌種配成0.5McFarland,取50μl於肉湯中35℃培養增菌24h後取1ml於離心管（1.5ml）中，-80℃反複凍融數次，培養無菌生長後於4℃離心機，以10000轉/min離心25min，取上清液後-80℃保存待用；(3)改良三維試驗［１］： 將銅綠假單胞菌標準株ATCC27853配成0.5McFarland密塗於M-H平板（Φ90mm）待幹後於平板中央貼上亞胺培南紙片，距紙片2mm處分別成180°打2個寬1mm、長2cm的槽（標明①②），在①加酶粗提液20μl、②加酶粗提液+EDTA（9：1）35℃培養24h後判斷結果    

　　結果判斷：①有擴大生長、②抑菌圈光滑完整則為產金屬酶；②有擴大生長、①抑菌圈光滑完整則為產金屬酶以外的碳青酶烯酶；①、②抑菌圈均光滑完整則為膜通透性障礙；(4)PCR：菌株處理：挑取少許新分離的純菌種置入內含無菌生理鹽水（100μl）的離心管（0.5ml），離心15000rmp5min，棄上清液，加裂解液A 50μl，裂解液B 2μl，混勻後置入55℃保溫1h後置入95℃保溫5min ，離心10000rpm30 min，上清液即為擴增的模板液。反應體係配製：將反應液管內液體全部移入耐熱酶管，以15μl至20小管，實驗時將5μl膜板液移入反應體係中並加蓋石蠟油2滴即可。熱循環參數：95℃預變性2min然後93℃30min→55℃30min→72℃60min共循環35周期，最後一個周期72℃延長至2min。結果觀察：取擴增產物10μl與2μl溴酚蘭指示劑混勻，點樣於2%瓊脂糖凝膠中，以100v電壓電泳20～30min，出現與陽性膜板分子量相同的條帶（193bp）即為陽性。

　　2.1  表型初篩結果 

　　２２株銅綠假單胞菌中有１０株產生協同現象占4５．4%。  

　　2.2  改良三維試驗結果 

　　２２株銅綠假單胞菌中有５株產金屬酶占22.７%。

　　2.3PCR結果  　　

　　２２株銅綠假單胞菌中有４株為OprD缺失，即由膜通透障礙引起占1８.８%。 

　　2.4  22株銅綠假單胞菌抗菌藥物敏感性統計見表1。表1  22株銅綠假單胞菌的抗菌藥物敏感性統計 （略）

亞胺培南是一種新型的β-內酰胺類抗生素，屬碳青酶烯類，具有較好的抗菌活性，且對β-內酰胺酶穩定［２］，是治療假單胞菌感染活性最強的藥物之一，但隨著臨床的廣泛使用，耐亞胺培南菌株開始出現並日益增多，嚴重限製了亞胺培南的應用。銅綠假單胞菌對亞胺培南耐藥常不是由單一因素造成的，目前認為造成本菌耐亞胺培南的已知主要原因有4種，即(1)產生β內酰胺酶：據Pai 等報道部分菌株可能產β-類酰胺酶［３］，本實驗中由於產金屬酶而耐藥的菌株為5株(22.7%)；(2)膜通透性障礙：即其外層細胞壁的外膜蛋白D2是碳青黴烯類抗生素進入的通道，失去特異性外膜蛋白D2導致藥物不能進入細菌體內，Statake等［４］認為患者接受過其他內酰胺類藥物抗感染治療後，會誘導銅綠假單胞菌失去其膜蛋白通道oprD2，從而對亞胺培南形成耐藥，本實驗OprD2基因擴增結果顯示：22株銅綠假單胞菌中有4株菌株表現為OprD2缺失(18.8%)；(3)細胞外膜主動外排係統的表達；(4)青黴素結合蛋白的改變：本實驗未涉及3、４點，在此也作詳敘述。以上可見碳青黴烯類抗生素耐藥機製的複雜性。因此，在治療銅綠假單胞菌引起的疾病時，建議在臨床上選擇抗菌藥物時以細菌培養為前提，藥敏實驗結果為依據，合理選擇敏感的藥物治療方案［５］，防止耐藥菌株的出現和傳播。

 

作者：李蘇婭 史煜波《浙江臨床醫學》

  　　1 陳東科，張誌敏，張秀珍.三維法檢測β-內酰胺酶的影響因素探討方法的改進.中華檢驗醫學雜誌，2003，26（10）：600～604.

　　2 朱琴，彭少華. 銅綠假單胞菌對碳青黴烯類抗生素的耐藥機製.醫學新雜誌，2002，12（4）：206～207.

　　3 Pai H , Kim J . Carbapenem resistance mechanis in pseudomonas aeruginosa clinical isolates. Antimicrob Ａgents Ｃhemother ,2001,45:480～484.

　　4 Statake S, Yoneyama H ， Nakae T. Role of Omp D2 and chromosomal βlactamase in carbopenem resistance in clinical isolates of pseudomones aeruoginosa. J Antimicrob Chemother ,1991,28:199～207.

5 葉曉光，王若倫. 銅綠假單胞菌耐藥性動態變化特征及分析. 中華醫院感染學雜誌，2004，14（6）：607～609.