中藥對產β－內酰胺酶大腸埃希菌的敏感性研究

【摘要】  目的 對產β－內酰胺酶（ESBL+）大腸埃希菌進行中藥體外敏感試驗，觀察其結構改變對中藥治療作用的影響。方法 采用瓊脂擴散法，以臨床收集的ESBL（+）大腸埃希菌30株為實驗組，非產酶的大腸埃希菌30株為對照組，進行體外敏感性研究，所選中藥通過水提、醇提法製備藥液，觀察各種藥物的最低抑菌濃度。結果 所試中藥體外抑菌效果從強到弱依次為：半枝蓮水提液、蒲公英醇提液、射幹醇提液、白頭翁醇提液、半枝蓮醇提液、魚腥草水提液、射幹水提液、白頭翁水提液、魚腥草醇提液、蒲公英水提液。對實驗組與對照組細菌的抑菌效果經統計學分析，差異無顯著性（P>0.05）。結論 對ESBL(+)大腸埃希菌引起的感染，在抗生素選擇壓力增大的情況下，中藥可以成為治療的較好選擇，無需實驗室對其確認是否產酶。

【關鍵詞】  中藥；產β－內酰胺酶大腸埃希菌；非產酶大腸埃希菌；體外敏感性

    近年，產β－內酰胺酶（ESBL+）大腸埃希菌引起的各類感染越來越多，治療此種細菌引起的感染，青黴素類、頭孢菌素類及氨曲南是無效的。細菌的產酶及突變是否影響中藥的治療作用呢？這一方麵未曾見有報道，為此筆者選擇了具有清熱解毒、清熱燥濕作用的中藥通過水提與醇提的方法製備藥液，對ESBL（+）大腸埃希菌進行了體外敏感性的對比研究，並對有效中藥進行篩選，現報告如下。

    1  實驗材料

    1.1  中藥選擇  魚腥草：三白草科植物蕺菜Horttuynia   cordata Thunb.的幹燥地上部分，切段。射幹：鳶尾科植物    射幹Belamcanda chinensis(L.)DC.的幹燥根莖，切片。蒲公英：菊科植物蒲公英Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz.、堿地蒲公英T.sinicum Kitag.或同屬數種植物的幹燥全草，切段。半枝蓮：唇形科植物半枝蓮Scutellaria barbata D.Don的幹燥全草，切段。白頭翁：毛茛科植物白頭翁Pulsatilla chinensis(Bge.) Regel的幹燥根，切薄片。以上藥物均購自我院中藥房。

    1.2  實驗菌株  來自本院門診及病房臨床標本中分離的大腸埃希菌（儀器：英國先德SENSITITRE全自動微生物鑒定儀，鑒定符合率95%以上）。選擇經鑒定為ESBL（+）大腸埃希菌30株為實驗組，ESBL(-)大腸埃希菌30株為對照組。

    ２  實驗方法

    2.1  中藥製備

    2.1.1  中藥水提液  取中藥魚腥草、射幹、蒲公英、半枝蓮、白頭翁各500g，分別置提取容器中，加水適量，浸泡20min，繼續加水6～8倍（根據藥物容積不同，加水量不同），加熱煎煮提取2次（2h, 2h），過濾去渣，合並2次提取液，慢火濃縮至500ml左右（1g/ml），灌封，備用［1］。

    2.1.2  中藥醇提液  取中藥魚腥草、射幹、半枝蓮、白頭翁各500g，分別置提取容器中，加65%乙醇適量，浸泡20min，繼續加提取溶劑6～8倍量，加熱煎煮提取2次（2h, 2h），過濾去渣，合並2次濾液，回收乙醇。慢火濃縮至500ml左右（1g/ml），灌封，備用［1］。

    2.2  ESBL確認  采用NCCLS推薦的抑製劑增強的紙片法進行，若任一複合紙片抑菌圈直徑與單一紙片抑菌圈直徑相比≥5mm，即判為產ESBLs菌，若<5mm，則判為非產ESBLs菌。所選擇的30株ESBL(+)菌中，頭孢噻肟陽性14株，頭孢噻肟、頭孢他啶二者均為陽性者16株，無單純頭孢他啶陽性菌株。

    2.3  菌液製備  挑取培養18～24h的純菌落，製成0.5麥氏單位，濃度相當於(1～1.5)×108cfu/ml的菌懸液，備用。

2.4  操作  先以打孔法進行預試，瓊脂稀釋法配製濃度。采用2倍稀釋法，配製成６份不同濃度的供試藥液，濃度依次為0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0312、0.0156，根據要求加入M-H瓊脂，裝瓶，滅菌，傾注平板。將每個平板分成若幹份，編號。取10μl菌懸液加到平板表麵，放35～37℃孵箱培養，24h觀察結果，並記錄，以48h無菌生長之最低濃度作為最低抑菌濃度（MIC）。

    3  結果

    經48h培養觀察，實驗組及對照組細菌在含有不同濃度的中藥平板上表現出不同的生長狀況，見圖1。其MIC結果見表1～3（為統計方便，對在濃度為0.5平板上仍有細菌生長之最終濃度定為1.0）。表1  不同中藥對兩組細菌的MIC比較 表2  中藥的不同提純方法對實驗組細菌的MIC比較表3  中藥的不同提純方法對對照組細菌的MIC比較從表1中可以看出，中藥魚腥草醇提液、射幹水提液、白頭翁水提液、蒲公英水提液對實驗組及對照組細菌的平均MIC值均在0.4以上，筆者認為其抑菌作用應視為較弱，但其複方的作用及在體內的作用如何尚有待進一步研究。魚腥草水提液、射幹醇提液、白頭翁醇提液、半枝蓮水提液、蒲公英醇提液對實驗組及對照組細菌在抑菌效果上經統計學分析，差異無顯著性（均P>0.05）。而半枝蓮醇提液對兩組細菌的MIC經統計學分析，差異有顯著性（P<0.05），醇提液對ESBL(+)大腸的作用優於ESBL(-)。

    從表２、表３中可以看出，魚腥草水提液、半枝蓮水提液對兩組細菌的抑菌效果均優於相應的醇提液，而射幹醇提液、白頭翁醇提液、蒲公英醇提液無論對實驗組細菌還是對對照組細菌抑菌效果均明顯優於相應的水提液，其MIC值經統計學分析，差異有非常顯著性（均P<0.01）。

    4  討論

近年來，由於抗生素的不合理應用，使細菌的耐藥性增強，多重耐藥菌株不斷增加，在醫院的各類感染中，革蘭陰性細菌仍是主要的感染菌，而其中又以大腸埃希菌為多［2］。大腸埃希菌是產酶的主要細菌，其產β－內酰胺酶的細菌分離率逐漸增加［3］。該酶是質粒介導的耐藥酶，它不僅能水解青黴素和第一、二代頭孢菌素，還能水解第三代頭孢菌素及氨曲南等，並且ESBL的耐藥基因編碼經常與其他的耐藥基因相聯結，從而使耐藥性更加複雜，抗生素選擇更加困難，出現了“抗生素耐藥危機”，給臨床治療帶來極大難度。目前針對非產酶大腸的中藥研究報道較多，但產酶大腸的諸多改變能否對中藥的抑製作用產生影響，這方麵的研究鮮有報道，筆者選擇了具有清熱解毒、清熱燥濕作用的中藥12味，並對其中的魚腥草、射幹、半枝蓮、蒲公英、白頭翁進行醇提、水提對比，為中藥在對抗特殊耐藥菌方麵的作用提供了科學有效的實驗資料，對中藥的推廣應用將產生重要意義。

  作者：吳國英，欒耀芳，孫進學，王軍，孔祥山 《中華醫學實踐雜誌》

【參考文獻】

  1 謝秀瓊.現代中藥製劑新技術.北京：化學工業出版社，2004,4.

2 古東東，段蘊鈾，張紅鷹，等.臨床標本細菌分離及細菌耐藥性監測.中藥醫院感染學雜誌，2003,13(1):67-70.

3 周田美，董曉勤，施新顏，等.產超廣譜β－內酰胺酶的檢測及藥敏分析.中華醫院感染學雜誌，2003,13(5):484-485.

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