腸道菌群失調對免疫細胞及細胞因子的影響

【摘要】  目的探討菌群失調對機體免疫細胞和細胞因子的影響。方法用卡那黴素製作小鼠腸道菌群失調的動物摸型，進行腸道菌群的定量分析，同時進行免疫細胞和細胞因子相關指標的測定。結果實驗組小鼠腸道內菌群數量明顯低於對照組（P<0.01）。菌群失調後實驗組小鼠較對照組脾細胞數、脾抗體形成細胞數減少，脾重量減輕（P<0.05或P<0.01）；實驗組小鼠血清白細胞介素-2（IL2）和粒巨噬細胞集落刺激因子（GMCSF）的含量較對照組低（P<0.01）。結論腸道菌群失調可減少機體的免疫細胞及降低細胞因子。

【關鍵詞】  小鼠；菌群失調；免疫細胞；細胞因子

 人和動物體內存在大量有益菌，這些菌不但對機體無毒、無害，而且參與宿主的消化、營養、代謝、吸收、免疫及抗感染的過程。大量研究證明，它在維持機體健康的微生態平衡中起著重要的作用。我們應用抗生素脫汙染使小鼠腸道菌群失調，然後觀察對機體免疫細胞及細胞因子的影響。

    1 材料和方法

    1.1 實驗動物

    純係BALB/C小鼠80隻，8周齡，體重18～22 g，雌雄各半，由河北醫科大學實驗動物學部提供。

    1.2 實驗材料

    卡那黴素由中國藥品生物製品鑒定所提供; 非選擇性培養基和選擇性培養基EMB、EC、BS、LBS（分別培養腸杆菌、腸球菌、雙歧杆菌、乳杆菌）均由天津金章醫用新技術研究所提供；豚鼠補體由本實驗室製備。

    1.3 實驗方法

    1.3.1 動物模型製備［1］

    將實驗動物隨機抽取實驗組和對照組，每組10隻。實驗組小鼠卡那黴素50 mg（稀釋量為0.4 ml）灌胃，每天上午1次，連續10 d；對照組小鼠蒸餾水0.4 ml灌胃，方法及天數同實驗組。所有小鼠10 d後采取摘眼球放眶血方法處死，盲腸內容物用於腸道菌群的培養，驗證動物模型是否準確建立。

    1.3.2 小鼠腸道菌群和脾重量的檢測

    實驗組和對照組小鼠各10隻,按上述方法製作動物模型,然後放眶血處死。取盲腸內容物0.1 g，置於放有玻璃球的小瓶中，加入0.9 ml無菌生理鹽水，加蓋，200 r/min在振蕩器上振蕩15 min，均質化的標本稀釋度為10-1，從此混合液中吸取0.2 ml，再加1.8 ml無菌生理鹽水，混勻，此標本稀釋度為10-2，繼續進行10倍稀釋至10-8。采用Mile與Misra所介紹的方法接種，每個稀釋度定量接種3個液滴。選擇適當的計算菌落的稀釋度進行菌落計算。結果以Log的菌落形成單位/克(CFU/g)表示。小鼠處死後用75％酒精浸泡2 min，取出後固定在蠟盤上，解剖腹腔，將脾髒與周圍組織分離取出，用濾紙吸除黏附的血液後，稱重。

    1.3.3 脾抗體形成細胞(PFC)測定

    實驗組和對照組各10隻小鼠，每日每隻50 mg卡那黴素灌服。服藥3 d後，同時用綿羊紅細胞（SRBC）免疫，5% SRBC腹腔注射0.4 ml，連續免疫4 d，再喂藥7 d後，斷頸處死小鼠，取出脾髒。將小鼠脾髒用100目鋼網和注射器芯研磨製成單個脾細胞懸液，用Hank液洗兩遍，1 000 r/min，離心15 min，每個脾細胞加6 ml Hank液混勻。取24孔板，每孔加180 μl Hank液，50 μl 1∶3稀釋的豚鼠補體，50 μl　10％SRBC，20 μl脾細胞，混勻，填充小室，蠟封小室邊緣，37℃ 1.5 h溫箱孵育，計數小室內空斑數量。

    1.3.4 白細胞介素(IL)2和粒巨噬細胞集落刺激因子(GMCSF)測定

    實驗組和對照組各10隻小鼠,模型建立和免疫同上,小鼠摘眼球處死，取眼眶靜脈血於試管中，靜置1 h後，離心，取血清。采用雙抗體夾心ELISA法分別按照試劑盒說明進行檢測。待測血清中的IL2、GMCSF與包被抗小鼠IL2、GMCSF單抗體結合，加入酶標抗體後形成複合物，後者與底物作用呈現顯色反應，429 nm處測OD值，IL2、GMCSF濃度與OD值成正比。檢測程序：①建立標準曲線；②加樣：待測品孔每孔各加入待測樣品100 μl；③將反應板充分混勻後置37℃,120 min；④洗板：用洗滌液將反應板充分洗滌4～6次，濾紙上印幹；⑤每孔中加入第一抗體液50 μl，將反應板置37℃,60 min，洗板同前；⑥每孔加酶標抗體工作液100 μl，將反應板置37℃,60 min，洗板同前；⑦每孔加底物工作液100 μl，置37℃暗處反應5～10 min，每孔加入1滴終止液混勻；⑧在429 nm處測吸光度值；⑨在半對數紙上畫出標準曲線，根據樣品的A值在曲線上查出相應的IL2、GMCSF含量。

2 結果

    2.1

    腸道正常菌群 見表1。 表1腸道正常菌群的測定結果

    2.2脾髒相關指標見表2。 表2脾髒相關指標的測定結果見表3。表3細胞因子的測定結果

　　3 討論

正常情況下，人體腸道內菌群與宿主間存在著相互依賴、相互製約的微生態平衡［2］，這種平衡的破壞，會對機體的許多生理功能造成影響，如免疫功能和造血功能等。抗生素能對微生態平衡造成破壞已被學界所關注。本實驗采用給小鼠灌服卡那黴素10 d後，經檢測發現，小鼠腸道雙歧杆菌、乳杆菌、腸球菌、腸杆菌的數量減少，此發現進一步說明抗生素可破壞腸道的微生態平衡，造成腸道菌群紊亂。脾髒是各類免疫細胞聚集的器官，也是對抗原物質產生免疫應答及免疫效應物質（如抗體等）的重要器官。研究發現，菌群失調或正常菌群數量的減少會使宿主的脾細胞增殖功能及IL1和IL2的活性明顯降低［3，4］。本實驗發現，菌群失調後會使小鼠脾髒重量減輕，脾細胞數和脾抗體形成細胞數減少，脾細胞內IL2的含量降低，結果提示由於缺乏正常菌群作為免疫原性物質刺激，影響了脾髒的正常發育，使脾髒萎縮和脾細胞功能低下，從而不但降低機體的特異性免疫功能，同時由於IL2的含量的減少，還會降低非特異性免疫功能。Simon等［5］研究發現菌群失調會影響骨髓循環幹細胞的數量，GMCSF是造血細胞因子家族的成員，主要由T淋巴細胞在抗原或絲裂原刺激下產生。本研究發現菌群失調後GMCSF的含量較正常小鼠減少，造成機體造血功能降低。從另一方麵反映出正常菌群可刺激機體的造血功能，刺激造血細胞因子GMCSF的分泌。在人腸道正常菌群中大約有400多種細菌［6］，雙歧杆菌、乳杆菌、腸杆菌和腸球菌等是優勢菌群。我們通過給小鼠抗生素灌胃，觀察了機體腸道菌群的變化，同時觀察了菌群失調後對機體免疫細胞及細胞因子的影響，結果提示抗生素可造成腸道正常菌群的失調，並且菌群失調後可對機體免疫細胞和細胞因子產生明顯影響，為研究機體免疫功能和造血功能提供了理論基礎，也提示臨床醫生要合理使用抗生素等，以減少菌群失調對機體產生的不良影響。

 

作者：張亞超 王沛　張玉玲　孫曉麗　劉穎　王仁傑   《白求恩軍醫學院學報》

  1 康白.正常菌群檢測法.見：範明遠，主編.康白論文集.第1版.北京微生態學雜誌編輯部.1989.101110.

2 康白.微生態學原理.大連:大連出版社,2002.1.

3 Nicaise P， Gleizes A，Sandre C，et al.Modulation of aspecific humoral immune response and changes in intestinal flora mediated through femented milk intake.FEMS Immunol Med Microbiol，1998,48（6）:585595.

4 孫延波,盛學成. 脫汙染小鼠免疫功能的實驗研究.中國微生態學雜誌，1995,7(2):13.

5 Simon D，Henk G，Froukje de B，et al.Influence of high versus low intestinal concentration of Gramnegative bacteria and Endotoxin on the susceptibility　of murine myelopoiesis in bone marrow and spleen to cytostatic treatment with AraC. Leuk Research,1992,16(10):985991.

6 康白.微生態學正在迅猛發展.中國微生態學雜誌，1995，7（4）：1.