紅曲菌株的分離純化和鑒定

【摘要】  ［目的］對紅腐乳中的紅曲菌進行分離純化和鑒定。［方法］根據紅曲菌嗜酸、耐乙醇的生長特性，用含乙醇的麥芽汁、含乳酸的大米培養基分離紅腐乳汁中的紅曲菌，並用對數稀釋平板法進行純化。純化後的紅曲菌顯微觀察確定其屬別。依照其在MEA培養基上25℃培養的菌落形態特征鑒定到種。［結果］從紅腐乳中分離的兩個菌株經鑒定M-1屬叢毛紅曲菌（M.pilosus），M-3屬紅曲紅曲菌（M.anka）。［結論］紅腐乳中分離的純培養為紅曲屬真菌。

【關鍵詞】  紅曲菌；分離；純化；鑒定

　　Abstract：［Objective］To isolate，purify and identify Monascus strains from red furu.［Method］Based on eosinophilic and ethanol tolerant characteristics of Monascus，stains were isolated from red furu by culturing on malt juice medium containing alcohol and rice medium containing lactic acid.Strains were purified using logarithmic plate dilution method，and then determined genera according to their micro-morphological characteristics.By culturing on malt extract agar medium with temperature of 25 degrees Celsius，strains were identified to species based on the morphological characteristics of colonies.［Result］M-1strain isolated from red furu was identified as Monascus pilosus and M-2 Monascus anka.［Conclusion］Strains isolated from red furn are Monascus fungi.

　　Key words：Monascus；isolation；purification；identification

    紅曲菌隸屬真菌界（Eumycophyta）子囊菌門（Ascomycota）真子囊菌綱（Euascomycetes）散子囊菌目（Eurotiales）紅曲菌科（Monascaceae）紅曲屬（Monascus）［1］，具有防腐，解毒；消食活血、健脾燥胃之功效［2］。我們根據紅曲菌嗜酸、耐乙醇的生長特性［1］，對市售紅腐乳中的紅曲菌進行分離純化，並對它們進行了形態學鑒定，為進一步發掘紅曲菌生物資源做了有益探索。

　　1.1  實驗材料 

　　(1)原料：市售紅腐乳、大米、瓊脂粉、乙醇、乳酸，麥芽浸出粉（malt extract）。(2)麥芽汁：麥芽浸出粉3g，蒸餾水100ml，PH3.54.0，分裝5ml/管，每管加95%乙醇2滴。(3)大米培養基大米10g，蒸餾水15ml，1%乳酸40ul。(4)麥芽汁培養基麥芽浸出粉6g，瓊脂粉4g，蒸餾水200ml，PH5.0～6.0。(5)麥芽提取物瓊脂（malt extract agar，MEA）培養基麥芽浸出粉2g，蛋白腖0.1g，葡萄糖2g，瓊脂粉1.5g，蒸餾水100ml，PH6.0。

　　1.2  方法

　　1.2.1  分離 

　　無菌條件下，紅腐乳汁經2層紗布過濾，取0.1ml濾液於5ml麥芽汁，一式3管，空白對照1管。32℃培養，觀察。挑取麥芽汁上長出的紅色菌體少許，置於大米培養基中，一式3皿，空白對照1皿。32℃培養，觀察。

　　1.2.2  純化 

　　從大米培養基上挑取紅色菌體少許於1ml無菌生理鹽水（NS）中，用對數稀釋平板法［3，4］獲得純培養。

　　1.2.3  鑒定 

　　取純化後的紅曲菌種，點種到MEA培養基32℃培養成熟。在載玻片上滴加一滴蒸餾水，用解剖針挑取少許菌絲，用50％乙醇浸潤，再用蒸餾水清洗一下，然後放入載玻片上的液滴中，仔細地用解剖針將菌絲分散開來，蓋上蓋玻片(勿使產生氣泡，且不要再移動蓋玻片)，製成水浸標本片，用顯微鏡觀察。取純化後的紅曲菌種，點種到MEA培養基25℃培養，觀察紅曲菌落大小、形態、色澤，氣生菌絲的產生情況。

　　2.1  分離 

　　接種紅腐乳汁的麥芽汁在3～4d後可見白色團狀菌絲，7d後菌絲轉為紅色，培養液亦呈紅色，而CK管中始終無菌體生長。3d後，接種分離菌的大米培養基上有微量無色菌體生長，6d後菌落明顯，呈白色，7d後菌落長大，粉紅色，8d後菌落更大，紅色。

　　2.2  純化 

　　將來自大米培養基的真菌稀釋液塗布於麥芽汁平板培養後發現菌體生長良好、無雜菌，並出現明顯的單菌落，編號為M-1～M-3……。

　　2.3  形態學鑒定 

　　顯微鏡觀察所分離的菌絲具不規則分枝，多核，有橫隔，含油滴，透亮或有深淺不一的紅、褐色色素，分生孢子著生在菌絲及其分枝的頂端，孢子單生或鏈狀，閉囊殼球形，有柄（圖1）。

    純化後的M-1菌株點種到MEA培養基，25℃培養，初期為圓形白色小菌落，7d後菌落圓形，直徑28mm，米色，氣生菌絲叢毛狀，菌落背麵紅色，有放射狀條紋（圖2）。

    純化後的M-3菌株接種到MEA培養基，25℃培養，菌落初期為圓形，白色，7d後菌落直徑8mm，鐵鏽色，中間裂開，邊緣較整齊，質地致密；25d後，菌落直徑22mm，深鏽色，中間隆起，裂開，邊緣有缺刻，無氣生菌絲，菌落背麵深赭色，有放射狀條紋（圖2）。

紅腐乳汁接種到含乙醇的麥芽汁中長出的菌產紅色色素、菌絲致密、成團生長，初步判斷為紅曲菌，再用含乳酸的大米培養基篩選祛除雜菌。這與紅曲菌的生態習性有關，同時也證實了在PH2.5和高達10%乙醇的培養條件下一般隻有紅曲菌才能生長。將分離菌株的顯微形態特征與紅曲菌(Monascus)的屬征［1］相對比，兩者基本吻合，進一步證實我們所分離的純培養M-1、M-3確為紅曲屬真菌。將純化後的分離菌株點種到MEA培養基，25℃培養，觀察其菌落生長形態特征，對照李鍾慶等的紅曲菌屬分類檢索表［1］，將M-1菌株鑒定為叢毛紅曲菌（Monascus.pilosus），M-3菌株鑒定為紅曲紅曲菌（Monascus.anka）。這不僅豐富了紅曲菌種庫，而且為進一步發掘紅曲菌生物資源奠定基礎。

 

 作者：丁紅梅  《浙江中醫藥大學學報》

  　　［1］李鍾慶，郭芳.紅曲菌的形態與分類學［M］.北京：中國輕工業出版社，2003：2，11，3-6，45-48.

［2］李時珍.本草綱目［M］.重慶：重慶出版社，20006：390.

［3］毛瑞豐，黃麗，仁紹坤.紅曲米中紅曲黴的分純及抗菌作用的研究［J］.廣西大學學報(自然科學版)，2006，31（4）：319-321.