【摘要】 【目的】 探討耐氟康唑白念珠菌基因多態性與其耐藥性是否相關。【方法】 收集48株敏感白念珠菌和10株耐氟康唑白念珠菌，其中包括2株體外誘導的耐氟康唑白念珠菌。選擇1個隨機引物（引物1251），采用任意引物PCR方法基因分型，將電泳圖譜掃描入計算機後采用Labwork4.0軟件轉化為數值圖表,利用SPSS 11.5進行聚類分析。 【結果】 引物1251的PCR指紋圖帶型穩定，多態性豐富，可以作為分型引物。聚類分析結果提示8株臨床耐藥菌的PCR指紋圖相似係數為71.7%，而其中7株的耐藥菌相似係數高達86.7%，遠高於58株菌的平均相似係數(47.3%)。2株體外誘導的耐藥菌誘導前後基因型未發生變化。【結論】 基因分型的結果未提示耐氟康唑白念珠菌存在一定的特殊電泳條帶，但提示了特定的PCR指紋圖可能與耐藥性有一定相關性。
【關鍵詞】 白念珠菌； 基因型； 氟康唑； 耐藥性，任意引物PCR
Abstract： 【Objectives】 To investigate the possible relationship of C. albicans gene polymorphisms and its fluconazole-resistance. 【Method】 Forty-eight fluconazole-susceptible stains and 10 fluconazole-resistant stains of C. albicans were analyzed, with two resistant stains induced in vitro. All of them were genotyped by arbitrary primed polymerase chain reaction (AP-PCR) fingerprinting employing one interrepeat primes (1251 primers). The image was captured using computer-assisted system with Labwork 4.0 software to analyze the gel patterns of all isolates. The data were processed by SPSS 11.5 statistical software. 【Results】 Primer 1251 was suitable for fingerprinting analysis, and was found to generate the reproducible fingerprinting profiles, yielding well-resolved banding patterns. The AP-PCR profiles of 8 resistant stains isolated clinically were highly similar according to similarity coefficient (71.7%). Furthermore, the similarity coefficient of 7 resistant isolates (86.6%) was significantly higher than that of total 58 stains (47.3%). For two induced isolates, their genotypes did not change much after resistance-inducement in vitro. 【Conclusions】 No specific DNA profiles of C.albicans indicating fluconazole-resistance were identified. However, our results demonstrated a strong genetic correlation between fluconazole-resistant patterns and its AP-PCR profiles in C.albicans.
Key words： C.albicans; genotype; fluconazole; drug resistance; AP-PCR
近年來隨著免疫抑製劑、抗腫瘤藥物、廣譜抗生素的應用及艾滋病流行，臨床上因白念珠菌感染所致的深部真菌病逐年增多，而過多、廣泛的使用抗真菌藥物所產生的選擇壓力，使念珠菌的耐藥現象有明顯增多的趨勢。白念珠菌的耐藥表型與基因型的關係目前仍不清楚，尋找一種恰當的基因分型方法，探討其與耐藥表型的關係，對監測耐藥株的分子流行病學，以及深化耐藥分子機製的研究有重要的臨床意義[1]。我們應用任意引物PCR（Arbitary primed -PCR）的方法對臨床分離的白念珠菌進行了基因分型，研究白念珠菌的耐藥性與基因多態性的關係。
1 材料與方法
1.1 受試菌株
8株耐氟康唑白念珠菌（MIC>64 μg/mL），分別從近兩年我院8名器官移植術後和骨髓移植術後患者的痰液中和深靜脈導管黏附物中分離得到。同期選擇了47株對氟康唑敏感的白念珠菌，均從我院患者的痰液、血液、靜脈導管拭子等分離培養得到。2株為我們利用體外氟康唑誘導後產生耐藥性白念珠菌（m90028,m113）另有1株標準的白念珠菌為ATCC90028，為我科實驗室保存。
1.2 藥物敏感性測定
氟康唑紙片擴散法初篩試驗采用2002年美國國家臨床實驗室標準委員會（NCCLS）認可的酵母菌紙片擴散法敏感試驗方法，對58株白念珠菌進行了氟康唑初篩實驗。采用Etest法測定耐藥菌株對常用抗真菌藥的最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration, MIC）。進行MIC測定的菌株為已經氟康唑紙片擴散法測定判為耐藥菌株。E test試紙條為瑞典AB.Biodisk公司出品，包括氟康唑(fluconazole) 0.016～256 μg/mL、二性黴素B (amphotericin B) 0.002～32 μg/mL、5-氟胞嘧啶(5-Fu) 0.002～32 μg/mL、酮康唑(ketoconazole) 0.002～32 μg/mL、伊曲康唑(itroconazole) 0.002～32 μg/mL。將5種E test試紙條按不同角度緊貼於培養基上，
1.3 白念珠菌DNA的提取
取保存在牛奶管中的菌種，分別劃線轉種至沙氏培養基上，
1.4 AP-PCR反應
根據文獻[10]選擇了1條寡核甘酸引物：引物1251(被稱之為真核細胞內重複序列)作為AP-PCR分型的隨機引物（由上海生物工程公司合成）,序列為5′－TGG GTG TGT GGG TGT GTG GGT GTG－3′。AP-PCR反應體係：PCR Premix 25 μL（含TaKaRa Taq 1.25 U，dNTPs各0.4 mmol/mL，Mg2+ 3 mmol/mL），白念DNA模板3 μL，Primer F 1 μL（20 μmol/μL），Primer B 1 μL（20 μmol/μL），ddH2O 20 μL，反應終體積50 μL。AP-PCR反應參數如下：
1.5 PCR產物電泳及分析
以DNA分子量100 bp DNA ladder plus marker為分子量標準，PCR產物在含0.5 μg/mL溴乙啶的
2 結 果
2.1 MIC值
表1為10株耐藥白念珠菌對5種常用抗真菌藥的MIC值。
2.2 PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳結果
8株臨床耐氟康唑白念珠菌、2株誘導產生耐藥株和48株敏感菌株的DNA模板經引物1251擴增，所得PCR產物電泳帶型穩定，得到的DNA多態性豐富，結果明確，對其中30株菌的AP-PCR反應重複3次，獲得了較為穩定的PCR指紋圖譜（圖1-4）。條帶數目多在1～9條之間，最小的片段約250 bp,最大的片段約2 200 bp，95%以上的片段集中在500～1 031 bp,90%的菌株有600和800 bp,不同菌株之間的數量和擴增片段的大小存在差異，即使帶型完全一致的菌株，有些片段的溴乙啶顯色強度也有區別，而通過熒光掃描輸入計算機轉化為數值圖表之後，菌株之間的差異更可以清晰的從數值的大小反應出來。
2.3 不同菌株的基因型之間的關係
聚類分析的結果顯示，2株體外誘導的耐氟康唑白念珠菌誘導前後基因型未發生變化，相似係數為100%。而8株臨床耐氟康唑白念珠菌的PCR指紋圖相似係數為71.7%，其中7株耐藥菌的相似係數高達86.6%，而58株菌的平均相似係數為47.3% （圖5為58株白念珠菌基因型的聚類樹狀圖）。
3 討 論
白念珠菌是目前臨床上最常見的深部真菌病的病原體，近年來隨著高危深部真菌患者的逐年增多，氟康唑在臨床上得到廣泛使用，其對氟康唑的耐藥率也在逐年上升[2,3]。我們收集了我院這3年多出現的8株耐藥白念珠菌,另采用體外氟康唑誘導的方法，誘導了2株耐氟康唑白念珠菌。經E-test法檢測，10株耐藥菌中對氟康唑的MIC值最低為64 μg/mL，最高為256 μg/mL , 有2株出現對5-Fu耐藥，4株對酮康唑的MIC值較高，2株出現對酮康唑耐藥（MIC=4 μg/mL），3株對伊曲康唑的敏感性較差，MIC值已達1.0 μg/mL，但都對二性黴素-B保持了較好的敏感性。我國目前缺乏對白念珠菌耐藥情況的大規模流行病學調查結果，對真菌的耐藥機製研究相對較少，迫切需要加強這方麵的研究。
目前各種抗真菌藥敏試驗檢測的是白念的耐藥表型，如果能在白念珠菌的耐藥表型和基因型之間找到某種客觀的聯係或直接運用基因分型的方法找出引起耐藥表型產生的單一多態性，就有可能對與該表型相對應的基因進行定位，從而可以在分子水平對耐藥性進行檢測，為監測耐藥的分子流行病學提供了一種方法，並可以大大加快白念珠菌耐藥分子機製的研究。從目前的研究看，堿基突變，片斷插入或缺失[4,5]，基因轉化，等位基因的缺失都是造成耐藥性產生的分子生物學基礎[1,6]，這就造成了白念珠菌的基因多態性與耐藥性產生的關係。
目前用於基因分型的方法有脈衝電泳技術（PFGE）、限製性內切酶分析與Souther blot雜交、基因芯片等，但這些技術煩瑣、費時或昂貴，而AP-PCR是建立在PCR基礎上的構建基因組圖譜的方法，也稱隨機引物PCP,由AP-PCR反應產生的指紋圖譜的多態性能夠用來鑒別親緣關係很近的個體間的差異。通過選擇不與基因組匹配得很好的單個引物及有目的降低退火步驟的嚴謹度，可重複的獲得信息量豐富的基因組指紋圖譜,因此能檢測近等基因係（或同類係）中的多態性。而且，經過設計可以將序列偏向的人工地加入引物中，使這些引物直接針對重複序列和基元序列，從而擴增出複雜的圖譜並可檢測多個多態性位點[7]。有學者曾采用RAPD(隨機擴增的DNA多態性)進行基因型與耐藥性的分析[8]，由於RAPD隻采用一個人工合成的不大於10個堿基的短核苷酸鏈隨機引物，極易產生假帶而影響辨別。近來，由於計算機輔助分析軟件的迅速發展，可以減少由於指紋圖譜複雜的帶型帶來鑒別上的人為誤差。Clemons等[9]將電泳結果掃描並用計算機軟件進行分析，提出了可以采用相似係數這一統計學概念評價菌株間的親緣關係。
我們利用AP-PCR的方法，根據文獻[10]選擇了1條寡核苷酸引物對10株耐氟康唑白念珠菌和48株敏感菌進行了基因分型，經過調整恰當的退火溫度和退火步驟，產生的DNA多態性豐富，帶型穩定性很好，可作為AP-PCR分型。與文獻不同的是，本研究將退火溫度降低，並設定了PCR反應首先進行5個低嚴謹度循環，然後再進行40個高嚴謹退火條件下的循環，由此產生了比文獻更為豐富PCR指紋圖。經過計算機熒光掃描指紋圖準確的確定了電泳條帶的大小，位置，產量大小等，最後將其電泳圖像轉化為數值圖表進行聚類分析，結果發現8株臨床耐藥菌株的平均相似係數為71.7%，其中7株的相似係數高達86.1%，遠高於58株菌的平均相似係數（47.3%）。這提示了耐氟康唑的白念珠菌耐藥表型與其基因型可能相關。其中兩株體外誘導的耐藥株的基因型在該次AP-PCR反應中提示誘導前後基因未發生變化，一種可能是非基因突變的機製導致了耐藥性的產生，另一種可能是發生了突變，但該引物未能反映出來。不同菌株即使擴增的產物相同，但同一PCR反應體係的產量之比可有明顯不同，這說明不同菌株的等位基因可存在差異，本實驗還未能判斷耐藥菌存在或缺失某一與耐藥相關的特殊條帶，但不能否定該種基因型的白念珠菌是否易於獲得後天的耐藥性。8株臨床耐氟康唑的白念珠菌的電泳條帶並不完全一致，而是表現出較高的多態性，這除與耐藥性的產生有多種途徑，還與AP-PCR實驗也有一定的相關性，如較低的退火溫度的產生了非特異的條帶，這可以通過重複試驗檢測糾正，但不適宜大量樣品的檢測。AP-PCR可以使得基因分型更簡單、自動、批量化，但必須要求PCR反應條件標準化，如采用相同的試劑和步驟，同時PCR產物的電泳條件也盡可能保持一致。進一步分析AP-PCR方法產生的DNA特殊標記還需要進行大量的耐藥分子流行病學調查數據，由於白念珠菌存在高度的遺傳多態性，如果在了解不同白念珠菌基因圖譜上設計更為恰當和有針對性的引物，采用精心設計的退火溫度，就能準確的識別基因型與耐藥性的關係，從而大大加快耐藥分子機製的研究。
作者：黃靜， 劉慧， 朱家馨， 周宇麒， 談淑卿， 張天托 《中山大學學報》
【參考文獻】
1.WHITE T C, MARR K A, BOWDEN R A. Clinical, celluar, and molecular factor that contribute to antifungal drug resistance [J]. Clin Microbiol Rev,1998，11(2):382-402.
2.PFALLER M A, MESSER S A, HOLLIS R J, et al. In vitro activities of ravuconazole and voriconazole compared with those of four approved systemic antifungal agents against 6970 clinical isolate of candida spp[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2002, 46(6): 1723-1727.
3.BARAN J Jr, KLAUBER E, BARCZAK J, et al. Trends in antifungal susceptibility among Candida sp. Urinary isolates from 1994 and 1998[J]. J Clin Microbiol, 2000，38(2):870-871.
4.FAVRE B, DIOMON M, RYDER N S, et al. Multiple amino acid substitutions in lanosterol 14а-demethylase contribute to azole resistance in Candida albicans[J]. Microbiology,1999，145:2715-2725.
5.ASAI K, TSUCHIMORI N, OKONOGI K, et al. Formation of azole?鄄resistant Candida albicans by mutation of sterol 14-demethylase P450[J]. Antimicrob Agents Chemother,1999，43(5):1163-1169.
6.WHITE T C, HOLLEMAN S, DY F, et al. Resistance mechanisms in clinical isolates of Candida albicans[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2002, 46(6): 1704-1713.
7穆裏斯KB，費裏F,吉布斯R. 陳受宜，朱立煌，等譯.聚合酶鏈式反應[M].北京：科學出版社，1998：276－279.
8.DASSANAYAKE R S, ELLEPOLA A N, SAMARANAYAKE Y H, et al. Molecular heterogeneity of fluconazole -resistant and -susceptible oral Candida albicans isolates within a single geographic locale [J]. APMIS， 2002, 110(4): 315-324.
9.CLEMONS K V, FEROZE F, HOLMBERG K, et al. Comparative analysis of genetic variability among Candida albicans isolates from different geographic locales by three genotypic methods[J]. J Clin Microbiol， 1997，35(6):1332-1336.
10.BARTIE K L, WILLIAMS D W, WILSON M J, et al. PCR fingerprinting of Candida albicans associated with chronic and other oral condition [J]. J Clin Microboiol, 2001, 39(11): 4066-4075.
