如何提高抑菌試驗速度的探討

【摘要】  目的 探討基層檢驗機構如何進行快速、準確的抑菌試驗。方法 用慶大黴素標準藥敏紙片對ATCC25922、ATCC25923進行K-B法操作，觀察結果分4個試驗組和1個對照組，每組操作重複10次，4個試驗組分別培養4h，4.5h，5h，5.5h，使用普通光學顯微鏡放大160倍觀察細菌生長情況，根據抑菌圈直徑進行初步判斷，對照組培養20h肉眼觀察，根據抑菌圈直徑進行最終判斷。結果第4h，4.5h觀察的結果與其他各組比較差異有顯著性(P<0.05)；第5h，5.5h和20h觀察的抑菌直徑相比差異無顯著性（P>0.05），說明第5h，5.5h的初步判斷與第20h的最終判斷吻合。結論普通光學顯微鏡放大160倍觀察細菌生長可以加快藥敏診斷速度。

【關鍵詞】  抑菌實驗；抑菌圈直徑；集落計數，微生物；細菌學

　　抑菌試驗是診斷細菌和指導臨床使用藥物以及檢驗新藥藥效的重要實驗。基層檢驗機構在無VITEK-32自動檢測係統［1］、分光光度計等儀器設備的情況下，如何提高藥敏紙片抑菌試驗的質量和速度是非常重要的。我們在長期的藥敏試驗中進行探討和總結，得出了以下方法，供大家參考。

　　1.1  材料  Muller-hinton Agar（杭州天和微生物試劑有限公司）、ATCC25922、ATCC25923（中國普通微生物保藏管理中心），GEN（慶大黴素紙片，杭州天和微生物試劑有限公司）、MOTIC普通光學顯微鏡（上海精密儀器儀表有限公司）。

　　1.2  方法

　　1.2.1  按每1000ml蒸餾水稱取Muller-hinton Agar 38g配備M-H瓊脂，按每個平皿（直徑9cm）25ml進行分裝。　

　　1.2.2  將孵育16～24h的ATCC25922、ATCC25923菌落分別接種於生理鹽水管中，校正濃度至0.5麥氏標準(相當於1.0×108CFU/ml)［2］。

　　1.2.3  用無菌棉試蘸取菌液，在試管內壁旋轉擠去多餘菌液後在MH瓊脂表麵均勻塗布接種3次，每次旋轉平板60度，最後沿平板內緣塗抹1周。

　　1.2.4  平板在室溫下幹燥3～5min後用無菌鑷子將GEN紙片緊貼於瓊脂表麵，置35℃孵育。

　　1.2.5  於第4h，4.5h，5h，5.5h通過普通光學顯微鏡放大160倍觀察，從GEN紙片邊緣開始往外觀察，以視野由清晰、潔淨變為模糊來判斷抑菌範圍，做出標記後量出抑菌圈直徑。第20h肉眼觀察量出抑菌圈直徑，本次實驗每種菌重複10次操作。

　1.2.6  統計學方法  使用F檢驗和Q檢驗。

　　2.1  ATCC25922第4h，4.5h，5h，5.5h，20h觀察量出抑菌圈直徑結果  見表1。

　　2.2  ATCC25923第4h，4.5h，5h，5.5h，20h觀察量出抑菌圈直徑結果  見表2。

　　表1  ATCC25922不同時間點觀察抑菌直徑比較（略）

　　經F檢驗發現有差異後進行Q檢驗，對多個均數進行兩兩比較如下：x1=21.26，x2=21.22，x3=21.16，x4=20.82，x5=20.42；Q1（1，2）=0.61，Q2（1，3）=1.54，Q3（1，4）=6.76，Q4（1，5）=12.91，Q5（2，3）=0.92，Q6（2，4）=6.15，Q7（2，5）=12.29，Q8（3，4）=5.22，Q9（3，5）=11.37，Q10（4，5）=6.15；P1>0.05，P2>0.05，P5>0.05，其餘均<0.05。

　　表2  ATCC25923不同時間點觀察抑菌直徑比較（略）

　　經F檢驗發現有差異後進行Q檢驗，對多個均數進行兩兩比較如下x1=22.77，x2=22.69，x3=22.64，x4=22.03，x5=21.42；Q1（1，2）=0.84，Q2（1，3）=1.37，Q3（1，4）=7.8，Q4（1，5）=14.24，Q5（2，3）=0.53，Q6（2，4）=6.96，Q7（2，5）=13.39，Q8（3，4）=6.43，Q9（3，5）=12.86，Q10（4，5）=6.43；P1>0.05，P2>0.05，P5>0.05，其餘均<0.05。

根據細菌生長曲線［3］，一般細菌的遲緩期是4h，遲緩期細菌生長緩慢，對數期細菌生長快，雖然第4h觀察時還是不能形成肉眼可以看得見的菌落或菌苔，但實際上已經有不少的細菌開始生長，因此抓住遲緩期過後的30min或1h已經有不少的細菌生長的特點使用顯微鏡放大160倍觀察，可以比較清楚區分細菌生長區和抑菌區。GEN紙片吸收水分，藥物逐漸擴散引起4～20h的抑菌圈直徑逐漸增大，其中4～5h期間抑菌圈直徑增大比較多，差異有顯著性(P<0.05)，可能是紙片吸收水分不夠，藥物沒有完全釋放；5～20h抑菌圈直徑增加比較小，差異無顯著性(P>0.05)，說明紙片藥物已經完全擴散。5h、5.5h、20h觀察的抑菌圈直徑比較P>0.05，說明第5h觀察結果做出的初步診斷與第20h觀察的結果做出的最終診斷相同。ATCC25922與ATCC25923的初步診斷結果與最終診斷結果都相同。因此通過顯微鏡放大觀察可以把抑菌試驗縮短11h。影響抑菌實驗質量的因素很多［4］，比如培養基的質量、藥敏紙片的質量、接種菌量、試驗操作質量、孵育條件、抑菌圈測量工具的精度和質控菌株本身的藥敏特性等均能影響紙片擴散法抗生素敏感試驗結果的準確性和精密度。這次實驗使用的GEN對ATCC25922、ATCC25923的質控抑菌圈直徑範圍分別為19～26mm，19～27mm，而得出的實驗結果均符合質控值範圍，說明本次實驗是成功的。綜上所述，在條件比較簡陋，沒有自動檢測係統、分光光度計的儀器設備的檢驗機構通過顯微鏡放大觀察同樣可以進行快速抑菌實驗，為臨床及時做出診治提供有力的幫助。

 

作者：黃衍強，李曉華，覃豔春，陳源紅，秦靜英  《右江民族醫學院學報》

  　　［1］ 劉文娟，周櫻，錢厚明，等.VITEK-32微生物檢測係統工作原理及常見故障［J］.醫療裝備，2005，(10)：42-43.

　　［2］ 徐淑雲，卞如濂，陳修.藥理實驗方法學［M］.北京：人民衛生出版社，2002.1651.

　　［3］ 周正任，李凡.醫學微生物學［M］.北京：人民衛生出版社，2003.20.

［4］ 俞樹榮，陳拯，張卓然，等.微生物學與微生物學檢驗［M］.北京：人民衛生出版社，2001.455.