【摘要】 針對環境中的壓力，細菌會采取不同的響應以維持自身的穩定。某些抗生素能夠誘導肺炎鏈球菌轉變為感受態細胞，提高細胞轉化率，從而產生更適宜生存的耐藥突變株。本文根據近年來有關感受態的研究，重點闡述肺炎鏈球菌中抗生素誘導的感受態與耐藥性之間的關係。
【關鍵詞】 肺炎鏈球菌； 抗生素； 感受態； 轉化； 耐藥性
Antibiotic stress induced competence and the drug
ABSTRACT Bacteria took different general responses to stress conditions for survival. In response to antibiotic stress, Streptococcus pneumoniae used competence as a fitnessenhancing strategy. Transformation contributed the genetic plasticity and played a central role in the pathogen adaptive resistance to the antibiotic therapy. This review focused on the relationship between competence and bacterial antibiotic resistance.
KEY WORDS Streptococcus pneumoniae; Antibiotics; Competence; Transformation; Resistance
1 經典理論中細菌耐藥性和抗生素壓力
青黴素的發現和使用，開啟了抗菌治療史上偉大的篇章。抗生素對於人類的健康事業功不可沒，但短短幾十年過後MRSA、VRE及其它耐藥菌的相繼出現，使這些曾經風光的抗生素陷入了兩難的境地。關於耐藥菌的出現，經典理論認為，自然界中存在固有的耐藥菌和耐藥基因，它們通過質粒傳遞或轉座子轉移等基因交流的方式，將耐藥基因傳遞給一些致病菌，從而產生了難以控製的超級耐藥致病菌如MRSA和VRE等［1］。對於耐藥菌而言，抗生素起到了一種篩選的作用：將藥物敏感性細菌殺死，為耐藥菌的生存排除了競爭的阻力，有利於耐藥菌群的生存和繁殖。
抗生素在臨床治療中的廣泛和長期使用，不可避免地導致耐藥菌的出現，給抗菌治療帶來了許多困難。另外，抗生素作為促生長劑被添加到動物飼料中，也是耐藥菌出現的誘因之一。這些用於飼料的抗生素大多數可以人畜共用，長期使用後篩選出的耐藥菌在人畜間傳遞很容易導致多種抗生素失效［1］。現在的臨床研究發現，耐藥菌出現頻率越來越高，耐藥程度越來越嚴重，如果僅僅歸咎於抗生素篩選出的固有耐藥菌，恐怕難以圓滿的解答。
抗生素同紫外線、離子射線、重金屬和化學誘變劑一樣，是一種環境壓力，對細菌的生存造成一定程度的威脅，甚至通過對菌體的損傷導致其死亡［2］。而細菌無處不在，充分說明了這一種群在各種惡劣環境中強大的生存能力和適應性。在遭受到環境壓力時，細菌會采取不同的應急策略來規避風險、修複損傷，甚至改變自身的結構來適應各種環境的變化，如UV照射下大腸埃希菌的SOS反應，高溫環境下的熱休克反應和芽孢的形成等等，這些都是細菌針對某種特定壓力的響應。 有研究表明，當有抗生素作用時，細菌並不是平靜地麵對死亡，它們中的一些亞群也會產生某些對於抗生素壓力的響應，如絲裂黴素C和喹喏酮在大腸埃希菌中誘發出的SOS反應。SOS反應是細胞的一種易錯修複機製，通過提高突變率降低菌體的死亡率［3，4］。但SOS反應並不是細菌中普遍存在的規律性反應，自然界仍存在許多非SOS型細菌，它們因為缺乏SOS反應體係，不能通過可誘導的修複來達到適應環境的目的，因此必須通過其它途徑加以補救。肺炎鏈球菌就是一種非SOS型細菌，在其菌體中沒有檢測到SOS反應相關的作用因子［5］。有實驗證明，肺炎鏈球菌中可誘導的感受態反應可作為一種SOS反應的替代，通過轉化作用最終產生更適宜生存的突變菌株［2］。
2 抗生素誘導的肺炎鏈球菌感受態
2.1 感受態和感受態調節係統
轉化，是一種基因交換的程序性機製，最早在肺炎鏈球菌中發現，現已證明存在於大多數細菌中。具有轉化能力的細菌在其生長的某一階段能夠自然形成感受態，在此狀態下的細胞具有吸附、吸收外源裸露DNA片段的能力。能夠產生感受態的細菌中普遍存在著一組受com調節子嚴密調控的感受態基因，在感受態刺激因子(competence stimulating peptide，CSP)的作用下開啟基因的表達，用於完成吸收並重組外源DNA的生命活動［6～8］。
由於肺炎鏈球菌對感受態刺激因子的作用反應迅速且高度同步，因此是研究感受態十分理想的模型［9，10］。肺炎鏈球菌中感受態基因的數量從最初發現的47個增加到124［9］或105［10］個(不同的文獻報道)，幾乎所有的基因都被組織在相鄰的基因簇中，被com調節子共同調控。它們按照功能和表達時間的先後，被劃分為早期感受態基因和晚期感受態基因。早期基因主要對感受態的形成起調節作用，並進一步促使晚期感受態基因的表達；晚期感受態基因主要負責細胞對外源DNA的吸附、吸收和重組［7］。
在肺炎鏈球菌com調節子所調控的基因中，僅22個基因為轉化所必需，其中8個基因(comA/B，comC/D/E，comX1comX2和comW)是早期基因組中的成員，編碼的產物存在於感受態調控級聯反應中［11，12］。肺炎鏈球菌感受態刺激因子(CSP)為comC基因的表達產物，被ComAB蛋白成熟並轉運。comC編碼一個45個氨基酸殘基的感受態前導肽，ComAB蛋白從此前導肽的GlyGly結構後切割出成熟的17個氨基酸殘基的小肽即成熟的CSP［8，13］。
comD/E是一個二因素調節單位，受CSP的調控。comD的基因產物為CSP的受體，是一種跨膜蛋白，含有7個跨膜的α螺旋。ComD具有組氨酸激酶的活性，與相應的CSP結合後可磷酸化激活ComE蛋白。ComE蛋白為一轉錄因子，被激活後產生多重效應：一是與操縱子comC/D/E的啟動子結合促進這三個基因的表達，形成自身誘導的正反饋效應；二是可激活具有σ因子活性的ComX蛋白，而ComX同RNA聚合酶形成複合物，啟動感受態晚期基因的表達。comW基因被認為是一種感受態所必需的依賴ComE的調節子，它通過阻止ClpP依賴的蛋白水解酶對ComX的水解作用來穩定ComX蛋白同RNA聚合酶的複合物，同時通過一些尚未明晰的機製來活化此複合物，使晚期基因的表達更加嚴密地被ComE傳導的信號所調控［14，15］(圖1)。
在com調節子控製的22個轉化必需基因中，剩餘的14個基因屬於晚期基因，它們編碼的蛋白質用於DNA的吸收(ccl，comEA/C，comFA/C，comGA/B/C/D/G)和處理單鏈DNA(coiA，dprA，recA和ssbB)［11］。至少有70個基因對轉化是非必需的，但由於感受態基因具有很多的重疊，因此它們不能被去除，並同時具備一些基因重疊後才有的功能［9］。這些“多餘”的基因和功能說明com調節子的作用不僅僅是誘導細胞形成感受態，還可能有著其它的作用。有研究者認為“感受態”已經不足以描述肺炎鏈球菌中comX所決定的生理狀態，因此開始傾向於使用一個中性化而不帶任何功能的詞語“X態”(X state)來描述這一生理狀態［16］。
2.2 抗生素誘導的細菌感受態
對比絲裂黴素C在大腸埃希菌中誘發出SOS反應［17］，研究者在肺炎鏈球菌中進行了相關試驗，使用了一個可轉錄的融合基因ssbB::luc，即一個Photinus 肺炎鏈球菌感受態調控係統pyralis內的可以編碼熒光素的報告基因luc和感受態晚期基因組中的ssbB的融合體［18］。ssbB基因是感受態晚期基因組中的一個代表，同時在SOS相關基因中也存在，它能夠編碼單鏈DNA結合蛋白SsbB，在基因重組中起到不可或缺的作用。加入一定濃度的絲裂黴素C後，觀察到融合基因表達水平上升，提示絲裂黴素C能夠誘導肺炎鏈球菌中重組相關基因ssbB的表達。對照實驗中采用一株com基因缺陷菌株，在加入絲裂黴素C後融合體不被表達［3］，這說明絲裂黴素C誘導重組相關基因ssbB的表達，需要在細胞具有完整的com基因的前提下進行，即細胞需要通過誘發感受態來開啟同源重組的生理活動。以上試驗證明某些抗生素如絲裂黴素C能夠誘導肺炎鏈球菌中com基因的表達，使正常細胞轉變為感受態細胞，促進細胞內部的轉化作用。
除了絲裂黴素C，氟喹諾酮類抗生素在肺炎鏈球菌中也能誘發感受態基因的表達［2，19］。絲裂黴素C通過阻礙複製叉的前進而影響染色體的複製；喹諾酮類抗生素(氟呱酸，左氧氟沙星和莫西沙星)的作用靶點是DNA解旋酶(拓撲異構酶II)，通過使拓撲異構酶與DNA發生共價交聯阻止DNA的複製［19，20］。由此可見，這兩類抗生素的作用機製都是阻礙細菌染色體的複製，當它們作為細菌生存環境中的壓力時可能傳遞著相同的信號，即在肺炎鏈球菌中可以誘發出相同的響應——感受態。
在其它抗生素試驗中，對於肺炎鏈球菌感受態的誘發情況各不相同。作用靶點為核糖體的抗生素很多，如氨基糖苷類抗生素、四環類抗生素和大環內酯類抗生素等，但由於核糖體內可作用的靶點較多，這些抗生素對感受態誘發的情況和機製更複雜。實驗表明氨基糖苷類的卡那黴素和鏈黴素可以在肺炎鏈球菌中誘導出感受態，而大環內酯類的紅黴素和四環素則無此作用［2，3］。並不是所有對DNA或RNA有損傷性的抗生素就一定能夠誘導出感受態，DNA促旋酶抑製劑新生黴素和RNA聚合酶抑製劑利福平就沒有這種誘導的作用。另外，糖肽類抗生素中的萬古黴素，β內酰胺類抗生素和第三代的頭孢菌素頭孢噻肟同樣也不能誘導細胞轉變為感受態［3］。究竟具有哪些特征的抗生素能夠誘發細胞形成感受態，目前尚未有定論。
3 肺炎鏈球菌感受態與耐藥突變
在肺炎鏈球菌中多種抗生素能夠誘導細胞轉變為感受態，這種轉變為遺傳轉化做好了生理上的準備。為了證明抗生素誘導的感受態細胞能夠有效率地進行遺傳轉化，研究者設計了一個試驗：將攜帶鏈黴素耐受基因的DNA片段加入到肺炎鏈球菌培養物中，同時加入一定劑量(625ng/ml)的鏈黴素，並用無鏈黴素添加的培養物作為對照。鏈黴素必須適量，避免導致菌體大規模死亡。結果顯示，在鏈黴素處理過的培養物中出現了耐受，而對照實驗中則沒有出現耐受，因此可以確定鏈黴素誘發的感受態細胞能夠有效吸收外源DNA用於同源重組。如果再加入一定量的CSP(100ng/ml)並不會進一步提高肺炎鏈球菌的轉化率，即抗生素能夠通過誘發感受態提高菌體的轉化效率，且這種誘發作用不依賴於CSP的含量［3］。同樣條件用絲裂黴素C或諾氟沙星替換鏈黴素重複此試驗，能夠觀察到同樣的現象。
當抗生素誘導細胞出現感受態後，細胞就能有效率地吸收合適的外源DNA片段，這為耐藥突變的出現提供了先決條件。但在肺炎鏈球菌群落中，如何有效率地獲取足夠並且合適的外源DNA用於遺傳轉化是研究人員關注的另一個問題。
針對肺炎鏈球菌的研究表明，同一個群落裏的細菌可以依照不同表型分為若幹個亞群。就可否誘導出感受態而言，分為感受態型細胞和非感受態型細胞［21，22］，這些不同亞群的細胞在遺傳背景上存在著某些差異。現在有研究者認為，正是這些不同亞群的細胞，為遺傳轉化提供了豐富的基因資源。在抗生素的作用下，一個細菌亞群被誘發成為感受態細胞，而另一個細胞亞群則被藥物殺死，後者為前者提供了充足的基因資源［23］。
現已在多個肺炎鏈球菌感受態誘發模型中觀察到非感受態細胞亞群被溶解的現象，即異體胞溶(fratricide/sobrinicide)現象［21］。這些被溶解的細胞可能是一些因突變而喪失轉化能力的細胞，或是一些仍具有轉化能力但卻有著不同表型的細胞。異體胞溶現象已被證實有一定生物學意義，是一種戰勝其它競爭者以取得生存優勢的策略。異體胞溶是感受態亞群采取的一種侵略性反應，通過殺死其它亞群的細胞來獲取溶菌後的營養物質，如DNA和氨基酸［24］。同時，感受態細胞也會釋放毒力因子和過敏介質來誘發感染，通過活化宿主體內的防禦組織來穩定與宿主間的聯係，獲得暫時的生存優勢。異體胞溶和遺傳轉化的協同作用可能暗示著兩者的組合作用會給環境壓力下的細菌帶來更多的生存優勢。
感受態相關基因的研究證實，四個晚期基因(cbpD，lytA，cibA和cibB)的產物與遺傳轉化作用無關，它們很可能在異體胞溶中起作用［22，24，25］。這些基因被CSP所誘導，分別編碼胞壁質水解酶(一種主要的自溶物質)和一種二肽細菌素。胞溶過程涉及到第三種溶菌酶LytC的作用，這種物質並不為CSP誘導的基因所編碼。同時，有兩種免疫因子被證明用來保護感受態細胞免受裂解［24］。同比枯草芽孢杆菌感受態的研究發現，枯草芽孢杆菌在誘發感受態的同時會啟動細胞內生產表麵活性劑的反應，這可能也是為了溶解其它細胞，釋放其中的DNA和氨基酸以備後續的遺傳轉化［26］。
4 總結和展望
當細菌麵臨環境壓力時，會采取不同的方式來應對，即針對壓力的響應，如當用絲裂黴素C作用於大腸埃希菌時能夠誘發SOS反應。但並不是每一種細菌中都存在SOS反應，一些非SOS型細菌如肺炎鏈球菌在麵臨生存壓力時必須采取其它的響應方式，以保證自身的生長繁殖。現有研究表明肺炎鏈球菌中感受態可作為SOS反應的替代。抗生素作為一種環境壓力，可以在肺炎鏈球菌中誘發出感受態，為後續的遺傳轉化做好生理上的準備，並且也能通過誘發異體胞溶作用提供合適的外源DNA片段，為遺傳轉化做好物質上的準備。
感受態在整體上是被嚴密控製的，通過在一些最有代表性的物種內研究感受態的調節機製，可以了解這一過程是如何同細胞的整體調節網絡聯係起來的。盡管對菌體誘發感受態的機製了解得尚不夠確切，但是這裏所有的數據都能夠說明誘發感受態的一個主要目的是通過轉化來實現整體的遺傳多樣化。感受態的誘導對於一些像肺炎鏈球菌這樣的非SOS型菌種來說是十分重要的，因為這可能是這些菌株實現遺傳多樣化的唯一途徑。
然而感受態的研究過程中還存在著許多未能解釋清楚的問題，如感受態相關基因中看似“多餘”的基因在壓力響應的過程中起到了怎樣的作用？是否能夠誘導感受態的菌種，都同時存在異體胞溶用來獲取同源DNA？抗生素誘導感受態的現象在細菌中是否普遍存在……，相信這些問題將會在今後的研究中逐一得到解決。
目前的研究結論告訴我們：抗生素作為環境中的壓力，能夠誘發細胞轉變為感受態。這也許能夠從理論上解釋一些抗生素濫用後耐藥菌頻出的原因。不合理地使用抗生素可能誘導細胞高頻率出現感受態，提高轉化後突變出現的頻率，通過抗生素的篩選作用，耐藥菌很快占據絕對的生存優勢，危害人體健康。這也警示我們必須合理使用抗生素，否則若幹年後麵對猖狂的耐藥菌，人類將陷入無藥可用的境地。
作者：齊曉丹 陳代傑《中國抗生素雜誌》
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