銅綠假單胞菌β-內酰胺類藥物耐藥相關基因(18種)研究

【摘要】  目的 了解臨床分離的銅綠假單胞菌中β內酰胺類藥物耐藥相關基因研究存在狀況。方法 自臨床分離40株對銅綠假單胞菌，采用聚合酶鏈反應(PCR)檢測耐藥基因型(TEM、SHV、CTXM1群、CTXM9群、OXA2群、OXA10群、PER、VEB、GES、CARB、IMP、VIM、SPM、GIM、DHA、MOX、FOX和oprD2)。結果 40株中CARB陽性18株(45.0%)、35株oprD2基因缺失(87.5%)，其餘基因均陰性。結論 臨床分離的銅綠假單胞菌CARB基因攜帶率高。 

【關鍵詞】  銅綠假單胞菌； β內酰胺酶類； 耐藥基因

  全國細菌耐藥性監測網所屬57家三級甲等醫院調查發現，2002年1月～12月，銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，Pa)臨床分離率為10.3%，僅次於大腸埃希菌(14.2%)列第二位［1］。近年來Pa菌耐藥率不斷增加，已經出現對第三代頭孢菌素和亞胺培南耐受的Pa菌，給臨床治療帶來極大困難。研究發現，Pa菌產生各種β內酰胺酶(如TEM、SHV、OXA、PER、VEB、GES、CARB)、金屬β內酰胺酶(如IMP、VIM、SPM、GIM)和質粒AmpC酶(如DHA、FOX、MOX)以及由於外膜孔蛋白D2(oprD2)缺失是對β內酰胺類藥物耐藥的主要機製［2～7］，但國內尚缺乏Pa菌β內酰胺類藥物耐藥相關基因全景式報道。為了解我院臨床分離的Pa菌對β內酰胺類藥物耐藥機製，本文繼對40株Pa氨基糖苷類修飾酶編碼基因研究［8］之後，檢測18種β內酰胺類藥物耐藥相關基因型(TEM、SHV、CTXM1群、CTXM9群、OXA2群、OXA10群、PER、VEB、GES、CARB、IMP、VIM、SPM、GIM、DHA、MOX、FOX和oprD2)，報告如下。

    1  材料與方法

    40株Pa菌的來源、藥敏試驗及細菌處理均與文獻［8］相同。

    基因檢測采用PCR法，各種靶基因引物序列和目的產物長度見表1。各種靶基因PCR擴增體係均為：每反應體係P1、P2引物各0.5μmol/L，KCl 10mmol/L，(NH4)2SO4 8mmol/L，MgCl2 2mmol/L，TrisHCl(pH9.0) 10mmol/L，NP40 0.5%，BSA 0.02%(wt/vol)，Taq DNA pol 1U。總反應體積20μl(其中模板液5μl)。熱循環參數(PCR產物長度>500bp)PCR為：93℃預變性2min，然後93℃ 60s→55℃ 60s→72℃ 60s，循環35周期，最後一個72℃延長至5min，其餘均為：93℃預變性2min，然後93℃ 30s→55℃ 30s→72℃ 60s，循環35周期，最後一個72℃延長至5min。產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，出現與陽性對照分子相當的目的條帶為陽性。耐藥基因檢測試劑盒、靶基因PCR引物序列和陽性對照DNA由無錫市克隆遺傳技術研究所提供。

    2  結果

    2.1  藥物敏感性試驗

    參見文獻［8］。

    2.2  基因PCR檢測

    40株Pa菌中CARB陽性18株(45.0%)、oprD2基因缺失35株(87.5%)，其餘基因均為陰性。圖1為balCARB基因PCR產物電泳圖，balCARB基因擴增產物經測序和BLAST程序分析(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTn)為CARB3型(與CARB3型基因序列［注冊號DQ359232］高度同源，一致率100%)，Pa03號株balCARB基因序列與GenBank中balCARB序列同源性聚類分析(軟件DNAMAN)見圖2；圖3為oprD2基因PCR產物電泳圖。轉貼於中國論文3  討論

1992年法國巴黎發現的TEM42是在Pa菌中第一個被報道的A類ESBLs［9］，最近國內報道在Pa菌中檢出TEM、OXA、IMP、VIM、GES和DHA β內酰胺酶等基因［10～15］。本組40株Pa菌中僅檢測到CARB型基因和oprD2基因缺失。CARB型基因編碼產生羧苄西林酶，為β內酰胺酶Bush分類中的2c，CARB型基因最早於1981年在Pa菌中發現［16］，近年又從不動   表2   與國內其它醫院Pa菌β內酰胺類藥物耐藥相關基因型檢測結果比較［菌株陽性數 杆菌、弧菌屬、奇異變形菌中檢出，已發現CARB19型9個亞型。羧苄西林是第一個用於抗假單胞菌感染的半合成青黴素類藥物，呱拉西林(第三代半合成青黴素類藥物)抗菌譜廣，抗假單胞菌活性比羧苄西林強數十倍，常用於治療Pa菌感染，但呱拉西林對β內酰胺酶不穩定［16］。羧苄西林、呱拉西林的抗菌活性受CARB型基因編碼產生的羧苄西林酶影響［17］。國內錢小毛等［18］報道在Pa菌中檢出CARB型基因，陽性率為30.8%，但未對CARB型基因的亞型進一步分型。我們研究中40株Pa菌中CARB型陽性18株(45.0%)。Pa03號株CARB型基因PCR擴增產物經測序和BLAST程序分析為CARB3型(與CARB3型基因序列［注冊號：DQ359232］高度同源，一致率100%)。我國CARB型基因流行亞型以及攜帶CARB型基因Pa菌對常用CARB型基因的耐藥特征未見報道。β內酰胺類抗生素對Pa的作用靶位是細菌內膜上的PBP2，該類藥物要到達其作用靶位必須首先經過外膜通道進入周漿間隙。如果菌株外膜蛋白通道減少或缺失，藥物難以到達其作用靶位，細菌將產生耐藥。本組40株Pa菌中oprD2基因缺失陽性35株(87.5%)，表明產羧苄西林酶和oprD2基因缺失是我院流行株，與近期報道的其它醫院相比，不同醫院檢出狀況不同。

 

  作者：王偉 陳瑛 錢芳 毛劍峰 薛武進《中國抗生素雜誌》

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