兔耳風提取物的抑菌作用研究

【摘要】  目的比較不同極性溶劑提取鐵燈兔耳風與杏香兔耳風成分對3種常見微生物的抑菌作用。方法采用水、70%乙醇、95%乙醇及醋酸乙酯等不同極性的溶劑提取；用管碟法測抑菌圈的大小進行抑菌實驗，用兩倍稀釋法進行最小抑菌濃度的測定。結果極性大的溶劑所提取出的成分對細菌（金黃色葡萄球菌）有明顯抑菌作用，杏香兔耳風水提取物的最小抑菌濃度為6.25%,鐵燈兔耳風水提取物的最小抑菌濃度為3.13%。極性小的溶劑提取出的成分對黴菌（白色念球菌）有抑菌作用。結論不同極性的提取物抑菌作用各不相同。

【關鍵詞】  兔耳風；提取物；抑菌作用

　　Abstract：ObjectiveTo compare the effect of different polarity extracting reagents Ainsliaea macroclinidioides and A. fragrans on three kinds of common microorganisms. MethodsThe active substance was extracted from Ainsliaea with water, 70% ethanol,95% ethanol and ethyl acetate. The inhibitory effect  was determined by adopting the cup plate method.The minimal inhibitory concentration (MIC)was tested by double dilution method in tubes.Results The extracts from strong polarity solvent had obvious inhibitory effect on bacteria(Staphylococcus aureus), and the minimal inhibitory concentration  of  A. fragrans was 6.25%when it was extracted with water, A. macroclinidioides was 3.13%. The extracts from weak polarity solvent had inhibitory effect on fungus(Candida albicans). ConclusionAntibacterial effects of Ainsliaea extracts by different polarity solvent are different．

　　Key words：Ainsliaea;   Extracts;   Inhibitory effects

    兔耳風屬Ainsliaea DC植物是菊科(Compositae)帚木菊族(Mutisieae Cass)，全世界七十餘種,分布於亞洲東南部。中國植物誌記載我國有44種4變種，除1種產於東北外，其餘均產於長江流域及其以南各省。兔耳風屬植物多為民間及地區常用中草藥，廣泛用於治療感冒咳喘、風濕痹痛、跌打損傷、活血止血、腸炎痢疾、咽喉炎及泌尿係統疾病等症。目前，對本屬植物的研究不多，且主要集中為化學成分方麵［1～5］。本實驗對杏香兔耳風和鐵燈兔耳風的不同溶劑提取物的抑菌活性進行初步研究。

　　1  材料與儀器

　　1.1  菌種

　　1.1.1  細菌金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)（25923）、大腸杆菌(Escherichia coli)（25922）由江西省兒童醫院檢驗科提供；

　　1.1.2 真菌白色念珠菌(Candida albicans)（90029）由江西省醫科所微生物室提供。

　　1.2 儀器

 

　　SHZ-D(Ⅲ)循環水式真空泵,RE52-99旋轉蒸發器,OLSB-5/10低溫冷卻液泵,高速中藥粉碎機,培養皿,移液管,牛津杯,試管,HF-105A數控電熱恒溫培養箱，YXQ-SG46-280型手提式壓力蒸氣消毒器等。

　　1.3 培養基

　　金黃色葡萄球菌、大腸杆菌用血瓊脂基礎培養基培養，白色念球菌用沙氏培養基培養。

　　1.4 藥材

　　鐵燈兔耳風Ainsliaea macroclinidioides Hayata和杏香兔耳風A. fragrans Champ.均采自江西婺源，並經筆者鑒定。

　　2 方法

　　2.1  鐵燈兔耳風提取物的製備

　　2.1.1 水提物

　　將鐵燈兔耳風剪碎後，用粉碎機適當粉碎，稱取200 g粉碎後藥材置於5 000 ml燒瓶中，加入蒸餾水，浸泡30 min。置電熱套中緩緩加熱至沸，並保持微沸狀態4 h，停止加熱，趁熱過濾，將水提液濃縮為浸膏。

　　2.1.2 醇提物

　　稱取粉碎鐵燈兔耳風藥材100 g置於燒瓶中，加入95%乙醇，浸泡30 min，回流提取2次，第1次2 h，第2次1.5 h。過濾，合並濾液。回收乙醇，將濾液濃縮至浸膏狀。同法可得70%乙醇提取物。

　　2.1.3 酯提物

　　稱取粉碎鐵燈兔耳風藥材100 g置於1 000 ml燒瓶中，加入500 ml醋酸乙酯，浸泡30 min。回流提取2次，第1次2 h，第2次1.5 h。過濾，合並濾液。回收醋酸乙酯得浸膏。

　　2.1.4 樣品製的製備

　　樣品液的製備將鐵燈兔耳風的4種提取物配製成含生藥量為50g/100 ml的樣品液。

　　2.2 杏香兔耳風提取物的製備

　　2.2.1 水提物

　　稱取粉碎杏香兔耳風藥材100 g置於燒瓶中，加入蒸餾水，其餘步驟同鐵燈兔耳風水提法。

　　2.2.2 醇提物

　　稱取粉碎杏香兔耳風藥材50 g置於燒瓶中，加入95%乙醇，其它操作同鐵燈兔耳風乙醇提取物提取法。用70%乙醇提取，其它操作同上，得70%乙醇提取物。

2.2.3 酯提物 

　　稱取粉碎杏香兔耳風藥材45 g置於燒瓶中，其它操作同鐵燈兔耳風醋酸乙酯提取物提取法。

　　2.2.4 樣品液的製備

　　將杏香兔耳風的4種提取物配製成含生藥量為50 g/100ml的樣品液。

　　2.3 種菌的準備

　　在超淨工作台上將大腸杆菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌分別接種於各自培養基上，在37 ℃恒溫培養箱中培養48 h。製成種菌備用。

　　2.4 培養基的準備

　　取30.4 g血瓊脂培養基於錐形瓶中，加入800 ml蒸餾水；取6.6 g沙氏培養基及瓊脂粉8 g於錐形瓶中，加入400 ml蒸餾水，與包紮好的培養皿、移液管、牛津杯、試管等一起放入滅菌鍋中高壓蒸氣滅菌20 min(103.4 kPa)。

　　2.5 抑菌活性的測定

　　培養基倒好平板後，冷卻至凝固。用接種環挑取上述活化後菌種，塗滿整個平板，蓋好平皿蓋，於培養箱中培養24  h，製成含菌平板。然後在平板上等距離分散的輕輕放上4個牛津杯，在杯內分別注入100 μl樣品液。以上操作均在無菌室內進行。

   

　　把每個處理過的培養皿放到如下條件培養：細菌37 ℃，24 h；黴菌24 ℃，48 h。測定抑菌圈直徑，取其平均值。並以此判斷兔耳風不同溶劑提取物對供試菌的抑製效果。

　　2.6 最小抑菌濃度(MIC)的測定(兩倍稀釋法)

　　根據抑菌圈的測定結果，選取金黃色葡萄球菌做最小抑菌濃度(MIC)的測定，選取杏香兔耳風和鐵燈兔耳風的水、70%乙醇、95%乙醇提取物做為樣品溶液。

   

　　挑取金黃色葡萄球菌一環接種於肉湯培養基中，放入培養箱培養24 h。取1支無菌試管倒入2 ml肉湯，接種已培養24 h的金黃色葡萄球菌一環，放入培養箱培養6 h。

   

　　取54支試管分為6組，每組9支。在1～6號試管中各加入1ml肉湯，並在1號試管中加入1 ml藥液，從第2支試管開始依次從前支試管取1 ml混合液加入下一支試管並混勻。從6號試管中吸取的1   ml直接棄去。將7號試管加入1 ml肉湯，8號、9號試管加入1 ml藥液。即每組試管樣品含生藥量濃度為：25，12.5，6.25，3.l3，1.56，0.78，0，50，50 g/100ml。將已培養6 h的菌液取出，各取一環加入10 ml肉湯中，適當振搖。用試管吸取，在1～8號試管中加入1滴含菌的肉湯。將上述試管置37℃培養箱培養。於 24 h取出，肉眼觀察結果，液體渾濁管為陽性管，液體澄清管為陰性管 ，找出最低藥物濃度的陰性管則為該種物質的最低抑菌濃度。

　　2.7 數據處理

　　實驗數據均為3次平行實驗結果的平均值。

　　3 結果

　　3.1 不同極性不同種類提取物抑菌活性比較

　　不同極性提取液對金黃色葡萄球的作用不同。見表1～2。其中杏香兔耳風水提取物對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑可達30 mm，但醋酸乙酯提取物對金黃色葡萄球菌無抑製作用。同時，杏香兔耳風的抑菌效果要優於鐵燈兔耳風。見圖1～2。表1  杏香兔耳風不同極性提取物的抑菌圈直徑（略）表2  鐵燈兔耳風不同極性提取物抑菌圈直徑（略）

　　3.2 最小抑菌濃度的比較

　　經過觀察培養物中試管透明度，同時對培養物用塗布平板法檢查細菌生長情況，計算兔耳風提取物的最小抑菌濃度。見表3～4。表3  杏香兔耳風提取物對金黃色葡萄球菌最小抑菌濃度（略）表4  鐵燈兔耳風提取物對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度（略）

    由表3～4可知，杏香兔耳風水提取物的最小抑菌濃度為6.25%，抑菌效果低於鐵燈兔耳風（最小抑菌濃度3.13%）；但70%，95%乙醇提取物的最小抑菌濃度分別為3.13%，6.25%，則抑菌效果略高於鐵燈兔耳風最小抑菌濃度。對照試管7號有大量菌生長。8，9號試管無菌。

　　4 討論

    通過兔耳風不同溶劑提取物對金黃色葡萄球菌、大腸杆菌、白色念珠菌3種常見微生物抑菌作用的測定，結果表明，杏香兔耳風與鐵燈兔耳風的四種不同極性提取物對金黃色葡萄球菌的抑製作用不同，抑菌作用由強到弱依次為：水>70%乙醇>95%乙醇，而醋酸乙酯提取物對金黃色葡萄球菌無抑製作用。由此表明，提取溶劑極性越強對金黃色葡萄球菌抑菌作用越強，並且隨著濃度的增加，各提取物對金黃色葡萄球菌的抑菌活性都得以提高。杏香兔耳風與鐵燈兔耳風的95%乙醇、醋酸乙酯提取物對白色念珠菌有一定的抑製作用；水、70%乙醇提取物對白色念珠菌無作用。但杏香兔耳風與鐵燈兔耳風的四種不同極性提取物對大腸杆菌都無抑菌作用。

   

目前已將杏香兔耳風為主藥製成片劑、顆粒劑和膠囊劑上市，主要用於治療宮頸糜爛［6］、子宮內膜炎［7］等疾病。民間驗方也有用杏香兔耳風配伍治療熱癤、鵝口瘡、蛇咬傷等。兔耳風不同溶劑的提取物，對細菌、黴菌有不同的抑菌作用，甚至沒有抑製作用，說明同一種藥材裏麵存在著不同極性的抑菌物質，本文為其在民間及臨床應用提供了一定的體外抑菌實驗依據。

 

作者：葛菲　張曉偉　裴各琴　陳武　賴學文　劉慶華《時珍國醫國藥》

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