牡丹葉總黃酮抑菌活性研究

【摘要】  　　目的分別測定了牡丹葉總黃酮提取液、經大孔吸附樹脂（D-101、HPD600）和超濾分離後的濃縮液對幾種常見微生物的抑菌活性。方法以抑菌圈直徑和最低抑菌濃度為指標。結果乙醇提取液對3種細菌的最低抑菌濃度(MIC)分別為：大腸杆菌5.08 mg/ml， 枯草芽胞杆菌2.54 mg/ml，沙門氏菌1.27 mg/ml；HPD600大孔吸附樹脂分離濃縮液對3種細菌的MIC值分別為：大腸杆菌4.92 mg/ml，枯草芽胞杆菌2.46 mg/ml和沙門氏菌1.23 mg/ml；D-101大孔吸附樹脂分離濃縮液對3種細菌的MIC值分別為：大腸杆菌3.13 mg/ml， 枯草芽胞杆菌3.13 mg/ml和沙門氏菌0.39 mg/ml；超濾工藝分離濃縮液對3種細菌的MIC值分別為：大腸杆菌4.048 mg/ml，枯草芽胞杆菌4.048 mg/ml和沙門氏菌1.012 mg/ml。結論牡丹葉總黃酮對3種細菌均有一定的抑製作用，其中對沙門氏菌的抑製作用最為顯著。

【關鍵詞】  牡丹葉 總黃酮 抑菌活性 大孔吸附樹脂 超濾

　　Abstract：ObjectiveTo study the antibacterial activity of the extraction solution and concentrated liquid of total flavonoids after separation of the macroporous resin (D-101, HPD600) and ultrafiltration from the leaves of peony. MethodsAntimicrobial circle diameter and minimum inhibitory concentration were used as the indexes. ResultsThe MIC of the ethanol extract to the three kinds of bacteria was as follows: E. coli 4.92 mg / ml, Bacillus subtilis 2.46 mg / ml, Salmonella 1.23 mg / ml; the MIC of the separation of the HPD600 concentrated liquid  to the three kinds of bacteria was as follows: E. coli 3.13 mg / ml, Bacillus subtilis 3.13 mg / ml, Salmonella 0.39 mg / ml; The MIC of the separation of the D-101 concentrated liquid  to the three kinds of bacteria was as follows: E. coli 4.048 mg / ml, Bacillus subtilis 4.048 mg / ml, Salmonella 1.012 mg / ml; The MIC of the separation of the UF concentrated liquid  to the three kinds of bacteria was as follows: E. coli 3.13 mg / ml, Bacillus subtilis 2.46 mg / ml, Salmonella 0.39 mg / ml.ConclusionThe total flavonoids from leaves of peony have a certain effect on the three kinds of bacteria, but the effect of Salmonella is the most notable respectively.

　　Key words：Leaves of peony;  Total flavonoids;  Antibacterial activity;  Macroporous resin;  Ultrafiltration

　　早期黃酮粗製品僅僅作為天然黃色素在染料方麵應用，20世紀20年代國外把槲皮素與蘆丁應用於臨床後，逐漸引起了人們的關注。科學家先後研究確定了黃酮類化合物具有抗氧化、清除自由基、消炎、調節血脂、抗癌、抗HIV等廣泛的生物活性。隨著科研技術的提高和研究的不斷深入，黃酮類化合物對微生物的抑製和殺滅作用逐漸引起了人們的重視。

　　近年來的研究更是涉及到具有抗菌能力的黃酮類化合物的分離提取方法，黃酮類化合物對微生物生物活性的作用、抗菌能力測定以及抗菌作用的構效關係等許多領域［1～8］。

　　牡丹Paeonia suffruticosa Andr. 為芍藥科芍藥屬牡丹組落葉灌木，是重要的觀賞植物和藥用植物。近年來，對於牡丹花和丹皮研究逐漸增多，但是對於牡丹葉的研究報道極少，所以，研究牡丹葉總黃酮的抑菌活性可以為牡丹葉在食品工業、製藥工業的應用提供一定的理論基礎，加大其資源利用率。

　　1  材料與方法

　　1. 1  牡丹葉總黃酮

　　1.1.1  牡丹葉2008-04采於洛陽牡丹廣場，品種：紫繡球。先將采集的牡丹葉去雜、漂洗晾幹後在65℃下在電熱恒溫幹燥箱中烘幹24 h，經粉碎機粉碎，過40目篩分樣備用。

　　1.1.2 總黃酮粗提液的製備準確稱取1.0 g左右的牡丹葉粉末，置於250 ml圓底燒瓶中，精密加入25倍量60%的乙醇，在80℃條件下加熱回流提取提取3 h，過濾，離心分離，用相應濃度的乙醇定容到100 ml，備用。黃酮純度為5.27%。

　　1.1.3  大孔吸附樹脂分離純化牡丹葉總黃酮粗提液將牡丹葉幹粉於60%的乙醇、80℃、料液比1∶25的條件下浸提3 h，抽濾，濾液於旋轉蒸發器中50℃下減壓濃縮至無醇味，回收乙醇。濃縮液用蒸餾水溶解，定容，測定吸光度，計算總黃酮含量，最後取一定量濃縮液再用蒸餾水定容，使其濃度為0.250 mg/ml左右，得稀釋液。分別稱取預處理好的大孔吸附樹脂各8.0 g於250 ml具塞三角瓶中，加入樣品溶液240 ml，室溫下放置8 h，過濾，濾去樹脂，用蒸餾水洗脫，洗至無醇味，再用160 ml的70%的乙醇水溶液進行洗脫6 h，過濾，旋轉蒸發濃縮洗脫液，得樣液，備用。HPD600得到的黃酮的純度為15.11%，D-101樹脂得到的黃酮純度為17.60%。

　　1.1.4  牡丹葉黃酮的超濾分離用切割分子量為10 000 Da，膜麵積為50 cm2 的超濾設備進行分離。黃酮純度為40.58%。

1. 2  培養基的配製普通營養瓊脂培養基：蛋白腖10 g，牛肉膏5 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 ml。l kg f.cm-2滅菌15 min。

　　1. 3  菌懸液的製備把大腸杆菌(Escherichia coli) 、枯草芽孢杆菌( Bacillus subtilis)和沙門氏菌（Salmonella）原菌種接種於普通營養瓊脂培養基斜麵上，37℃培養20～22 h，用l0 ml滅菌生理鹽水洗下菌苔備用。把上述菌懸液分別用滅菌的生理鹽水配製成含菌數106cfu.ml-1的菌懸液。

　　1.4 抑菌活性測定采用濾紙片法［8］。

　　1.5 最小抑菌濃度(MIC)的測定采用兩倍稀釋法［9］。

　　2 結果

　　2.1  抑菌活性測定

　　2.1.1  牡丹葉總黃酮粗提液抑菌活性測定牡丹葉總黃酮粗提液抑菌活性效果見表1。表1  牡丹葉總黃酮粗提液對幾種微生物的抑菌圈直徑（略）

　　由表1可知，牡丹葉總黃酮粗提液對大腸杆菌、枯草芽孢杆菌和沙門氏菌都有較強的抑菌作用。對沙門氏菌的抑菌作用尤為強烈。對枯草芽孢杆菌的抑菌作用相對較弱。

　　2.1.2  HPD600樹脂分離黃酮抑菌活性測定測定出HPD600樹脂分離黃酮對於不同菌種的抑菌圈直徑。見表2。表2  HPD600樹脂分離黃酮對幾種微生物的抑菌圈直徑（略）

由表2 可知，HPD600樹脂分離黃酮液對大腸杆菌、枯草芽孢杆菌和沙門氏菌有明顯的抑菌作用，對沙門氏菌的抑菌作用尤為強烈。對大腸杆菌的抑菌作用相對較弱。

　　2.1.3   D-101樹脂分離黃酮抑菌活性測定測定出D-101樹脂分離黃酮對於不同菌種的抑菌圈直徑。見表3。表3  D-101樹脂分離黃酮對幾種微生物的抑菌圈直徑（略）

　　由表3 可知，D-101樹脂分離黃酮液對大腸杆菌、枯草芽孢杆菌和沙門氏菌有抑菌作用。對沙門氏菌的抑菌作用尤為強烈。對大腸杆菌的抑菌作用相對較弱。

　　2.1.4  超濾分離黃酮抑菌活性測定測定出超濾分離黃酮對於不同菌種的抑菌圈直徑。見表4。表4  超濾分離黃酮對幾種微生物的抑菌圈直徑（略）

　　由表4可知，超濾分離黃酮對大腸杆菌、枯草芽孢杆菌和沙門氏菌有抑菌作用。對沙門氏菌的抑菌作用尤為強烈。對大腸杆菌的抑菌作用相對較弱。

　　2.2 最小抑菌濃度(MIC)的測定(兩倍稀釋法)

　　2.2.1  牡丹葉總黃酮粗提液最小抑菌濃度(MIC)的測定牡丹葉總黃酮粗提液最小抑菌濃度(MIC)的測定結果見表5。表5  牡丹葉總黃酮粗提液對幾種微生物的最小抑菌濃度（略）

　　 表5說明牡丹葉總黃酮粗提液對細菌確有較強的抑菌作用，MIC值分別為：大腸杆菌5.08 mg/ml， 枯草芽胞杆菌2.54 mg/ml，沙門氏菌1.27 mg/ml。

　　2.2.2  HPD600樹脂分離黃酮最小抑菌濃度(MIC)的測定HPD600樹脂分離黃酮最小抑製濃度結果見表6。表6   HPD600樹脂分離黃酮對幾種微生物的最小抑菌濃度（略）

　　表6 說明HPD600樹脂分離黃酮對細菌確有較強的抑菌作用，MIC值分別為：大腸杆菌4.92 mg/ml，枯草芽胞杆菌2.46 mg/ml，沙門氏菌1.23 mg/ml。

　　2.2.3   D-101樹脂分離黃酮最小抑菌濃度(MIC)的測定D-101樹脂分離黃酮最小抑菌濃度(MIC)的測定結果見表7。表7   D-101樹脂分離黃酮對幾種微生物的最小抑菌濃度（略）

　　表7說明D-101樹脂分離黃酮對細菌確有較強的抑菌作用，MIC值分別為：大腸杆菌3.13 mg/ml，枯草芽胞杆菌3.13 mg/ml，沙門氏菌0.39 mg/ml。

　　2.2.4 超濾分離黃酮最小抑菌濃度(MIC)的測定超濾分離黃酮最小抑菌濃度(MIC)的測定結果見表8。表8   超濾分離黃酮對幾種微生物的最小抑菌濃度（略）

　　表8 說明超濾分離黃酮對細菌確有較強的抑菌作用，MIC值分別為：大腸杆菌 4.048 mg/ml，枯草芽胞杆菌4.048 mg/ml，沙門氏菌1.012 mg/ml。

　　3  結論

　　牡丹葉總黃酮對3種細菌均有一定的抑製作用，其中對沙門氏菌的抑製作用最為顯著，對大腸杆菌的抑製作用相對較弱；乙醇提取液對3種細菌的最低抑菌濃度(MIC)分別為：大腸杆菌5.08 mg/ml， 枯草芽胞杆菌2.54 mg/ml，沙門氏菌1.27 mg/ml；HPD600大孔吸附樹脂分離濃縮液對3種細菌的MIC值分別為：大腸杆菌4.92 mg/ml，枯草芽胞杆菌2.46 mg/ml，沙門氏菌1.23mg/ml；D-101大孔吸附樹脂分離濃縮液對3種細菌的MIC值分別為：大腸杆菌3.13 mg/ml， 枯草芽胞杆菌3.13 mg/ml， 沙門氏菌0.39 mg/ml；超濾工藝分離濃縮液對3種細菌的MIC值分別為：大腸杆菌4.048 mg/ml，枯草芽胞杆菌4.048 mg/ml，沙門氏菌1.012 mg/ml。4種供試樣品液最低抑菌濃度(MIC)測定亦說明：牡丹葉總黃酮對3種細菌均有一定的抑製作用，其中對沙門氏菌的抑製作用最為顯著。

分離純化的黃酮對沙門氏菌的抑製效果強於粗提總黃酮，說明牡丹葉黃酮是一種很好的沙門氏菌抑製劑，但具體是哪種黃酮成分在起作用還有待於進一步研究。牡丹葉黃酮粗提物對大腸杆菌和枯草芽孢杆菌的抑製作用強於分離純化的黃酮，可能還存在其它成分對這兩種細菌的抑製作用，其作用機製還有待於更深一步的揭示。

作者：唐浩國，單方方，魏曉霞，李葉，劉嚴，向進樂，徐寶成  《時珍國醫國藥》

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