民族藥響鈴草的體外抑菌活性研究

【摘要】  　　目的探討響鈴草的體外抑菌作用。方法采用打孔瓊脂擴散法和稀釋法對響鈴草不同溶劑提取物進行抑菌實驗研究。結果響鈴草的不同溶劑提取物對供試細菌和真菌（金黃色葡萄球菌、大腸杆菌、藤黃微球菌、綠膿杆菌以及黃黴菌）均有一定程度的抑製作用。結論響鈴草提取物有明顯的體外抑菌作用。

【關鍵詞】  響鈴草； 抑菌； 最小抑菌濃度； 抑菌圈

　　Abstract：ObjectiveTo study the antibacterial activities of different solvent extracts of Crotalaria ferruginea Grah.MethodsBy the agar diffusion and dilution method,minimal inhibitory concentration(MIC) and inhibitory circle of the extract were determined.ResultsThe antibacterial activity of the extracts was different to different microbes.ConclusionCrotalaria ferruginea Grah has good antibacterial activity in vitro.

　　Key words：Crotalaria ferruginea Grah;   Antibacterial;  MIC；  Inhibitory circle

　　響鈴草為豆科狗屎豆屬植物假地藍Crotalaria ferruginea Grah的全草或帶根全草［1］。響鈴草為多年生草本，花期6～10月，生於山坡、荒地［2］。在貴州、雲南較為常見，為貴州侗族常用藥之一［3］。響鈴草味苦、微酸、性寒，在貴州民間用於久咳痰血、耳鳴耳聾、頭暈目眩、慢性腎炎、扁桃體炎、淋巴腺炎、疔毒惡瘡以及月經不調等［4］。

　　目前文獻中尚無響鈴草的抑菌作用報道，本實驗首次對其不同溶劑提取物對常見致病革蘭氏陽性、革蘭氏陰性菌以及黃黴菌的抑製活性進行了研究，為闡明其抗菌特性以及響鈴草的進一步開發利用和尋找新的抗菌藥物提供基礎。

　　1  材料與方法

　　1.1  材料與儀器

　　1.1.1  材料響鈴草購於貴州省藥材公司，產地：四川，包裝批號060702 。

　　1.1.2  試劑石油醚，醋酸乙酯，甲醇，乙醇，95%乙醇，二甲基甲酰胺均為分析純，購於貴陽中興化學試劑公司。

　　1.1.3  菌種購自中國微生物菌種保藏中心，金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus；大腸杆菌Escherichia coli；糞鏈球菌Enterococcus faecalis；黃黴菌Aspergillus flavus；綠膿杆菌Pseudomonas aeruginosa；藤黃微球菌Micrococcus luteus。

　　1.1.4  培養基MRS固體培養基：酪蛋白腖10 g，牛肉提取物10 g，酵母提取物5 g，葡萄糖5 g，乙酸鈉5 g，檸檬酸二銨2.0 g，Tween 80 1.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，MnSO4·H2O 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，CaCO3 20.0 g，瓊脂15 g， 定容至1 000 ml，pH值 調至6.8；營養肉湯固體培養基：蛋白腖10 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，瓊脂15 g，定容至1 000 ml，pH值 調至7.0；查氏固體培養基：硝酸鈉3 g，磷酸氫二鉀1.0 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，蔗糖30 g，瓊脂15 g，液體培養基組成除了不加瓊脂外，與相應的固體培養基相同。

　　1.1.5  儀器高低溫恒溫培養箱（上海一恒科技有限公司），旋轉蒸發儀（BUCHI R-200），SHZ-D(Ⅲ)循環水式真空泵（鞏義市予華儀器有限公司），電子天平（OHAUS）淨化工作台（上海市純昱科學儀器有限公司），真空冷凍幹燥機（LABCONCO），超低溫冰箱（Forma Scientific），雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司TU-1901）。

　　1.2   方法

　　1.2.1  響鈴草不同溶劑提取物的製備方法將幹燥的響鈴草粉碎過40目篩，稱取等量的響鈴草3份，每份150 g，分別置於1 000 ml的水、酒精、醋酸乙酯中。每種溶劑浸泡3次，每次置於恒溫（37℃）揺床上（200 r/min）振蕩12 h，抽濾得到提取液。水的提取液於-80℃冷凍過夜後用真空冷凍幹燥機幹燥；酒精提取液40℃減壓旋轉濃縮除去酒精，於-80℃冷凍過夜後用真空冷凍幹燥機幹燥；醋酸乙酯提取液先減壓濃縮除去醋酸乙酯，得浸膏。

　　1.2.2  對響鈴草不同溶劑提取物的抑菌活性檢測

　　菌種培養：金黃色葡萄球菌staphylococcus aureus，大腸杆菌Escherichia coli，綠膿杆菌Pseudomonas aeruginosa，藤黃微球菌Micrococcus luteus采用營養肉湯培養基（組成成分見上）活化培養，糞鏈球菌Enterococcus faecalis采用MRS培養基（組成成分見上）活化培養，黃黴菌Aspergillus flavus采用查氏培養基（組成成分見上）活化培養，分別將各菌種濃度調至OD600約為1，待用。

　　采用試管稀釋法對最低抑菌濃度（MIC）的測定：取上述得到的水和酒精溶劑的粗提物0.1 g，溶於 1 ml無菌水中，醋酸乙酯溶劑的提取物0.1 g溶於1 ml DMF，使其充分溶解，用細菌過濾器過濾，取0.3 ml樣品溶液以相應的液體培養基倍比稀釋成樣品濃度分別為50, 25, 12.5, 6.25, 3.13, 1.57, 0.79 mg/ml，每管300 μl。分別在試管中加入30 μl菌液（OD600約為1），置於37℃恒溫培養16 h。分別取100 μl菌懸液均勻塗板。然後放37℃溫箱靜止培養24 h後取出， 每梯度塗布3個平板。此過程重複兩次，測定最小抑菌濃度（MIC）［5］，篩選出抑菌活性最強的組分。

　　抑菌圈的測定：取各溶劑的浸提物30 mg，分別用相應的溶劑（無菌水、乙醇、醋酸乙酯）1 ml，製成30 mg/ml的樣品溶液，用細菌過濾器過濾。在相應的固體培養基平板上加0.1 ml菌液，均勻塗布。稍幹後用8 mm打孔器打孔，每孔加0.1 ml樣品，37℃培養24 h，測量抑菌圈大小。

2  結果

　　2.1  響鈴草不同溶劑提取物MIC比較見表1。采用試管稀釋法對響鈴草3種溶劑提取物的最低抑菌濃度的進行測定，結果表明響鈴草的3種溶劑提取物對供試的細菌及真菌具有不同的抑製作用：

　　水溶劑浸提物的總體抑菌活性較強，對藤黃微球菌、黃黴菌均有較好的抑製作用，最低抑菌濃度均為12.5 mg/ml；對金黃色葡萄球菌、大腸杆菌、綠膿杆菌的最低抑菌濃度均為50 mg/ml；對糞鏈球菌的最低抑菌濃度大於50 mg/ml。

　　乙醇溶劑浸提物的總體抑菌活性稍弱，對黃黴菌和綠膿杆菌的抑製作用較好，最低抑菌濃度均為25 mg/ml；對其它的供試菌的抑製效果較差，對金黃色葡萄球菌、大腸杆菌、藤黃微球菌的最低抑菌濃度均為50 mg/ml；對糞鏈球菌的最低抑菌濃度大於50 mg/ml。

　　醋酸乙酯溶劑浸提物的抑菌活性顯著，對金黃色葡萄球菌、大腸杆菌和綠膿杆菌均有較好的效果，最低抑菌濃度均為12.5 mg/   ml；對其它的供試菌的抑製效果稍弱，對藤黃微球菌和黃黴菌的最低抑菌濃度均為25 mg/ml；對糞鏈球菌的最低抑菌濃度大於50 mg/ml。

　　從各種供試細菌及真菌對響鈴草浸提物的敏感性上來看，不同菌種對不同溶劑提取物的敏感性不同：金黃色葡萄球菌、大腸杆菌和綠膿杆菌對響鈴草的醋酸乙酯提取物較為敏感，最低抑菌濃度均為12.5 mg/ml；藤黃微球菌和黃黴菌對於響鈴草的水提物較為敏感，最低抑菌濃度為12.5 mg/ml；而糞鏈球菌對響鈴草的3種溶劑浸提物均不敏感，最低抑菌濃度均大於50 mg/ml。

　　表1  響鈴草不同溶劑提取物最低抑菌濃度（略）

　　2.2  響鈴草不同溶劑提取物的抑菌圈結果見表2。與MIC的結果基本一致， 響鈴草不同溶劑提取物對各種供試菌的抑菌活性不同，響鈴草醋酸乙酯溶劑的提取物對金黃色葡萄球菌，大腸杆菌，綠膿杆菌和黃黴菌的抑製效果較強，抑菌圈直徑大於10 mm；響鈴草水浸提物對藤黃微球菌和黃黴菌的抑製效果較強，抑菌圈直徑均大於10 mm；響鈴草乙醇浸提物對黃黴菌的抑製效果較強，抑菌圈直徑為11 mm。

　　從供試菌種對不同溶劑提取物的敏感性來看，金黃色葡萄球菌、大腸杆菌和綠膿杆菌對於醋酸乙酯溶劑的提取物最為敏感，抑菌圈直徑均大於10 mm；藤黃微球菌和黃黴菌對於響鈴草的水浸提物最為敏感，抑菌圈直徑均大於10 mm；糞腸球菌對3種溶劑的浸提物均不敏感，抑菌圈直徑均小於5 mm。

　　表2  響鈴草不同溶劑提取物抑菌圈直徑（略）

　　3  討論

　　近年來，由於抗生素的不合理使用導致了耐藥菌株的增加，降低了現有抗生素的效率，嚴重地威脅著人類的健康。減少耐藥菌株的生成以及研製新的抗菌藥物已成為目前醫學界的重要課題。中草藥幾千年來為中國人的健康作出了重大貢獻，在現代預防和控製細菌性感染疾病方麵也發揮了積極作用。由於中草藥的特殊性，細菌較少對中草藥產生耐藥。因此，研究和開發抗菌中藥對解決耐藥菌株的產生和抗生素短缺問題具有重要意義［6］。

本實驗首次對侗族藥響鈴草的水提取物、乙醇提取物、醋酸乙酯提取物的抑製部分細菌及真菌的作用進行了研究。我們采用體外微生物敏感試驗測定方法，評價和比較了侗族藥響鈴草不同溶劑提取物的體外抑菌效果，實驗結果表明響鈴草不同溶劑提取物均有明顯的體外抑菌作用。因此，本研究為其抗菌活性和抗菌機理的研究打下基礎，也為進一步開發侗族藥響鈴草提供了研究數據，下一步的研究工作我們將對其進行活性指導下的活性化合物的進一步分離純化。

作者：周英 王慧娟 段震  李燕黃赤夫《時珍國醫國藥》

【參考文獻】

  　　［1］ 全國中草藥匯編編寫組. 全國中草藥，第1版，下冊［M］.北京：人民衛生出版社，1978：410.

　　［2］ 江蘇新醫學院. 中藥大辭典［M］.上海：上海科學技術出版社,1977：1649.

　　［3］ 貴陽市衛生局. 貴陽民間藥草［M］.貴陽：貴州人民出版社，1959：9.

　　［4］ 蕭成紋，龍智忠，李向明. 侗族民間單方拾萃(九)［J］.中國民族民間醫藥雜誌， 2002，6：358.

　　［5］ 沈 萍，範秀容，李廣武. 微生物學實驗，第3版［M］.北京：高等教育出版社，1996：6.

［6］ 曾春蘭，鍾振國. 中藥抗菌作用的研究進展［J］.廣西中醫學院學報，2006，9（1）：51.

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