石蓮子的體外抑菌活性研究

【摘要】  　　目的通過初步篩選發現石蓮子提取具有較好的抑菌活性，探討石蓮子不同溶劑提取物的抑菌作用。方法製備石蓮子不同溶劑提取物，采用打孔瓊脂擴散法和稀釋法對石蓮子不同溶劑提取物進行抑菌實驗研究。結果實驗數據表明石蓮子的不同溶劑提取物對供試的細菌和部分真菌（金黃色葡萄球菌、大腸杆菌、藤黃微球菌、綠膿杆菌、糞鏈球菌以及黃黴菌）均有一定程度的抑製效果，且不同溶劑提取物對各種供試菌的抑菌活性不同。結論石蓮子的不同溶劑提取物對部分細菌和真菌有一定程度的抑製效果，這將為進一步全麵開發石蓮子提供基礎。

【關鍵詞】  石蓮子 抑菌 最小抑菌濃度 抑菌圈

　

　　Abstract:ObjectiveThis research intended to study the antibacterial activities of different solvents extracts of nelumbo nucifera Gaertn.MethodsVarious extracts were prepared from Nelumbo nucifera Gaertn,and the the minimal inhibitory concentration(MIC) and inhibitory circle of the extract were determined.ResultsThe results showed that the antibacterial activity of the extracts was different toward different microbes.ConclusionThe experimental date demonstrated that extracts of nelumbo nucifera Gaertn exhibited strong antibacterial activities. This research is benefit for further study and use of the Nelumbo nucifera Gaertn.

　　Key words:Nelumbo nucifera Gaertn;   Antibacterial;   MIC；  Inhibitory circle

　　石蓮子又稱為甜石蓮、蓮實、殼蓮子、帶皮蓮子, 來源於睡蓮科植物蓮Nelumbo nucifera Gaertn的成熟果實，英文名為NELUMBINIS LB［1］。本品為橢圓形，兩端略尖，長1.8 cm左右，直徑約1.2 cm。外殼灰黑色，表麵平滑，一端有小圓凹點，另一端有微小短柄，殼厚約1 mm內含蓮子1枚。質堅硬，不易破裂［2］。石蓮子具有補益脾胃、祛熱毒、清心除煩的功效，可用於緩解和治療冷熱嘔吐、食物不下、淋濁等症狀［3］。據報道，從石蓮子中提取的蓮心堿具有降壓、抗心率失常等作用［4］，而石蓮子在抑菌方麵的研究卻未見報道。本研究在初步篩選中發現石蓮子具有較好的抑菌活性，為充分發掘石蓮子的市場潛力，開發其可利用性，本文對石蓮子不同溶劑浸提得到的各提取物對常見致病革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌及黃黴菌的體外抑菌活性進行了研究，為闡明其抗菌特性以及進一步開發這一新資源提供參考。

　　1  器材與方法

　　1.1  材料與儀器

　　1.1.1  材料石蓮子購於貴州省藥材公司，產地：廣西，包裝批號060702。

　　1.1.2  試劑石油醚，醋酸乙酯，甲醇，乙醇，95%乙醇，二甲基甲酰胺，均為分析純, 購於貴陽中興化學試劑公司。

　　1.1.3  菌種購自中國微生物菌種保藏中心，金黃色葡萄球菌staphylococcus aureus；大腸杆菌Escherichia coli；糞鏈球菌Enterococcus faecalis；黃黴菌Aspergillus flavus；綠膿杆菌Pseudomonas aeruginosa；藤黃微球菌Micrococcus luteus。

　　1.1.4  培養基MRS固體培養基：酪蛋白腖10   g，牛肉提取物10 g，酵母提取物5 g，葡萄糖5 g，乙酸鈉5 g，檸檬酸二銨2.0 g，Tween80 1.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，MnSO4·H2O 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，CaCO3 20.0g，瓊脂15 g， 定容至1 000 ml，pH值 調至6.8；營養肉湯固體培養基：蛋白腖10 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，瓊脂15 g，定容至1 000 ml，pH值 調至7.0；查氏固體培養基：硝酸鈉3 g，磷酸氫二鉀1.0 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，蔗糖30 g，瓊脂15 g，液體培養基組成除了不加瓊脂外，與相應的固體培養基相同。

　　1.1.5  儀器高低溫恒溫培養箱（上海一恒科技有限公司），旋轉蒸發儀（BUCHI R-200），SHZ-D(Ⅲ)循環水式真空泵（鞏義市予華儀器有限公司），電子天平（OHAUS）淨化工作台（上海市純昱科學儀器有限公司），真空冷凍幹燥機（LABCONCO），超低溫冰箱（Forma Scientific），雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司TU-1901）。

　　1.2   方法

　　1.2.1  石蓮子不同溶劑提取物的製備將幹燥的石蓮子粉碎過40目篩，稱取等量的石蓮子3份，每份150 g，分別置於1 000 ml的水、酒精、醋酸乙酯中。每種溶劑浸泡3次，每次置於恒溫（37℃）揺床上（200 r/min）振蕩12 h，抽濾得到提取液。水的提取液於-80℃冷凍過夜後用真空冷凍幹燥機幹燥；酒精提取液40℃減壓旋轉濃縮除去酒精，於-80℃冷凍過夜後用真空冷凍幹燥機幹燥；醋酸乙酯提取液先減壓濃縮除去醋酸乙酯，得浸膏。

　　1.2.2  對各部分粗提物的抑菌活性檢測菌種培養：金黃色葡萄球菌（staphylococcus aureus），大腸杆菌（Escherichia coli），綠膿杆菌（Pseudomonas aeruginosa），藤黃微球菌（Micrococcus luteus）采用營養肉湯培養基（組成成分見上）活化培養，糞鏈球菌（Enterococcus faecalis）采用MRS培養基（組成成分見上）活化培養，黃曲黴（Aspergillus flavus）采用查氏培養基（組成成分見上）活化培養，分別將各菌種濃度調至OD600約為1，待用。

采用試管稀釋法對最低抑菌濃度（MIC）的測定：取上述得到的水和酒精溶劑的粗提物0.1 g, 溶於1 ml無菌水中，醋酸乙酯溶劑的提取物0.1 g溶於1 mlDMF，使其充分溶解，用細菌過濾器過濾，取0.3 ml樣品溶液以相應的液體培養基倍比稀釋成樣品濃度分別為50, 25, 12.5, 6.25, 3.13, 1.57, 0.79 mg/ml，分別在試管中加入30 μl菌液，置於37℃恒溫培養16 h。分別取100 μl菌懸液均勻塗板。然後放37℃溫箱靜止培養24 h後取出， 每梯度塗布3個平板，整個過程重複兩次，測定最小抑菌濃度（MIC），篩選出抑菌活性最強的組分［5］。

　　抑菌圈的測定方法：取各溶劑的浸提物30 mg，分別用相應的溶劑（無菌水，乙醇，醋酸乙酯）1 ml，製成30 mg/ml樣品溶液，用細菌過濾器過濾。在相應的固體培養基平板上加0.1 ml菌液，均勻塗布。稍幹後用8 mm打孔器打孔，每孔加0.1 ml樣品，37℃培養24 h，測量抑菌圈大小。

　　2  結果

　　2.1  石蓮子不同溶劑提取物MIC比較抑菌實驗結果見表1。采用試管稀釋法對石蓮子3種溶劑提取物的最低抑菌濃度的進行測定，結果表明石蓮子的3種溶劑提取物對供試菌具有不同的抑製作用：表1  石蓮子不同溶劑提取物各組分的最低抑菌濃度（略）

　　水溶劑浸提物對藤黃微球菌有很明顯的抑製作用，最低抑菌濃度為6.25 mg/ml；對金黃色葡萄球菌、黃曲黴的抑製效果較好，最低抑菌濃度均為12.5 mg/ml；對大腸杆菌、綠膿杆菌的抑製效果稍差，最低抑菌濃度為25 mg/ml；對糞鏈球菌的最低抑菌濃度為50 mg/ml。

　　乙醇溶劑浸提物對金黃色葡萄球菌、大腸杆菌、藤黃微球菌、綠膿杆菌的抑製作用較好，最低抑菌濃度均為12.5 mg/ml；對其它的供試菌的抑製效果稍差，對糞鏈球菌和黃曲黴的最低抑菌濃度為25 mg/ml。

　　醋酸乙酯溶劑浸提物對黃曲黴抑菌活性顯著，最低抑菌濃度為6.25mg/ml；對其它的供試菌的抑製效果稍弱，對金黃色葡萄球菌、綠膿杆菌的最低抑菌濃度均為25 mg/ml；對大腸杆菌、藤黃微球菌和糞鏈球菌的最低抑菌濃度為50 mg/ml。

　　從各種供試菌對石蓮子浸提物的敏感性上來看，不同菌種對不同溶劑提取物的敏感性不同：黃曲黴對石蓮子醋酸乙酯提取物很敏感，最低抑菌濃度為6.25 mg/ml；綠膿杆菌對石蓮子的酒精的提取物較為敏感，最低抑菌濃度為12.5 mg/ml；金黃色葡萄球菌對石蓮子的水和酒精的提取物均較為敏感，最低抑菌濃度為12.5 mg/ml；大腸杆菌對石蓮子的酒精提取物較為敏感，最低抑菌濃度為12.5 mg/ml；藤黃微球菌對石蓮子的水提取物很敏感，最低抑菌濃度為6.25 mg/ml；糞鏈球菌對石蓮子的酒精提取物較為敏感，最低抑菌濃度為25 mg/ml。

　　2.2  不同溶劑提取物的抑菌圈結果抑菌實驗結果見表2。石蓮子不同溶劑提取物對各種供試菌的抑菌活性不同。石蓮子醋酸乙酯溶劑的提取物對金黃色葡萄球菌、綠膿杆菌、藤黃微球菌和黃黴菌的抑製效果較強，抑菌圈直徑均大於10 mm；石蓮子水浸提物對金黃色葡萄球菌，藤黃微球菌和黃黴菌的抑製效果較強，抑菌圈直徑均大於10 mm；石蓮子乙醇浸提物對大腸杆菌的抑製效果較強，抑菌圈直徑等於10 mm。表2  石蓮子不同溶劑提取物抑菌圈直徑（略）

　　3  討論

　　近年來，有關石蓮子和其中的有效成分蓮心堿的研究很多，涉及到各個方麵［6］，但石蓮子具有抗菌作用卻一直未見報道。本研究對石蓮子的水、乙醇以及醋酸乙酯提取物的抑菌作用進行了研究，為全麵開發石蓮子的藥用價值提供研究基礎。

本研究采用體外微生物敏感實驗測定方法，評價和比較了石蓮子不同溶劑提取物的體外抑菌效果，實驗結果表明石蓮子不同溶劑提取物均有明顯的體外抑菌作用，且不同溶劑提取物對各種供試菌的抑菌活性不同，這很可能意味著有不同的化合物具有抑菌作用，下一步的研究工作我們將對其進行活性指導下的活性化合物的進一步分離純化。

作者：周英，段震，李純純，黃赤夫《時珍國醫國藥》

  　　［1］Cui Shude, Traditional Chinese medicine collected works［M］, Hei Longjiang science and technology publishing company in Ha Erbin,637.

　　［2］李雅文，郝金德.石蓮子與苦石蓮應區別藥用［J］.時珍國醫國藥,2004,15(4):229.　　

　　［3］蒲有能，衛愛黎.石蓮子的民間用法及成分初探［J］.中國民族民間醫藥雜誌,1998,2：20.

　　［4］Ling ZQ, Xie BJ, Yang EL. Isolation, characterization, and determination of antioxidative activity of oligomeric procyanidins from the seedpod of Nelumbo nucifera Gaertn［J］. J Agric Food Chem. 2005，53(7)：2441.

　　［5］Ping Shen, Fan Xiurong,.Microbiology experiment(the third edition)［M］.Advanced education publishing company of Beijing,1996：2.

［6］許磊，姚崇舜，陳濟民.蓮心堿的研究概況［J］.中草藥,2000,12：956.